基于网络药理学和分子对接法探讨汉黄芩素抗呼吸道病毒感染的机制

刘树军，黄 勇，林 琨，杨建宇★

（1.南宁市中医医院，广西 南宁 530001 ；2.广西医科大学附属武鸣医院，广西 南宁 530199）

呼吸道感染是儿童最常见的疾病之一，其具体临床表现的差异较大，可为症状轻微的上呼吸道感染，也可发展成比较严重的下呼吸道感染，严重时可引起呼吸衰竭，甚至致人死亡[1]。据统计，全世界每年约有200 万的5 岁以下儿童因呼吸道感染而死亡[2]。绝大多数的呼吸道感染都是由呼吸道病毒（Respiratory virus）引起的[3]，临床上常见的呼吸道病毒包括甲型流感病毒（Influenza A Virus，FluA）、乙型流感病毒（Influenza B Virus，FluB）、副流感病毒Ⅰ型（Parainfluenza virus Ⅰ，PIV Ⅰ）、副流感病毒Ⅱ型（Parainfluenza virus Ⅱ，PIV Ⅱ）、副流感病毒Ⅲ型（Parainfluenza virus Ⅲ，PIV Ⅲ）、呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）、腺病毒（Adenovirus，ADV）等[4]。汉黄芩素（Wogonin，即5，7-二羟基-8- 甲氧基黄铜）是唇形科植物黄芩的主要活性成分之一[5]。该物质属于黄酮类化合物，其分子式是C16H12O5。有研究表明，汉黄芩素具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性，但其是否可以用于呼吸道病毒感染的治疗，仍需进一步探究[6-10]。本研究旨在通过网络药理学结合分子对接法对汉黄芩素抗呼吸道病毒感染的靶点和通路进行系统的生物信息学分析，推测其潜在的作用机制，进而为后续研究提供一定的科学依据和方向。

1 材料与方法

1.1 潜在靶点数据的收集

在Pubchem 网站以“wogonin”为关键词下载汉黄芩素的3D 化合物结构，将其上传至PharmMapper服务器，筛选出Z ＞0 的数据导入至Uniprot 数据库，得到各个靶点的官方名称（Gene Symbol），随后利用gprofiler 网站将Gene Symbol 转换为Gene ID，构建汉黄芩素相关靶点数据库。以常见呼吸道病毒为关键词，在GeneCards 数据库进行搜索，剔除重复数据，建立呼吸道病毒感染靶点数据库。利用在线韦恩图Venny 2.1 软件对上述两个靶点数据库进行交集比对，收集汉黄芩素抗呼吸道病毒感染的潜在靶点数据。

1.2 富集分析

将获取的潜在靶点信息输入到生物学信息注释数据库（DAVID）中进行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析[11]，根据P≤0.05 对结果进行筛选分析，随后利用R 4.0.4 软件对其进行可视化处理。

1.3 “化合物—靶点—通路”网络图的构建

根据富集分析的结果，将潜在作用靶点上传至STRING 在线软件，获取蛋白相互作用网络信息。运用Cytoscape 3.7.1 软件对结果进行可视化处理，再将化合物、通路和疾病信息导入软件，以度值（degree）的大小反映节点的大小，以介数值（EdgeBetweenness）反映边的粗细，利用软件的Merge 功能构建“化合物—靶点—通路”网络图。利用插件CytoHubba 分析网络度（Degree）值，将Degree 值较高的靶点作为潜在关键靶点用于分子对接。

1.4 分子对接

在PDB 数据库下载潜在关键靶点的3D 结构，利用PyMOL 软件对靶蛋白进行去水、去除配体等修饰处理，应用Discovery Studio 2016 软件（简称DS）进行加氢、加电荷处理，赋予ChARMm 力场，将其定义为对接受体。随后对经过前期处理的靶蛋白与汉黄芩素采用LibDock 方法进行对接运算分析。

2 结果

2.1 潜在靶点数据库的建立

利用PharmMapper 服务器将汉黄芩素与2241 个人源蛋白靶标进行反向对接，对汉黄芩素进行靶点预测，筛选出Z ＞0 的74 个靶点，将其校正为Gene Symbol，并转换成相应的Gene ID。通过GeneCards数据库共收集到与呼吸道病毒感染相关的靶点528个，对上述两组靶点进行交集比对，得到17 个汉黄芩素与呼吸道病毒的共同靶点，见图1 和表1。

图1 汉黄芩素与呼吸道病毒的共同靶点Venn 图

表1 潜在靶点数据库

2.2 GO 富集分析和KEGG 通路注释

根据显著性程度，GO 富集分析和KEGG 通路注释均以P≤0.05 表示具有统计学意义。经GO 富集分析共得到75 个GO 条目，主要涉及蛋白质磷酸化、磷脂酰肌醇3- 激酶信号的正调控性、信号转导等生物过程（Biological process，BP）；在细胞成分（Cellular components，CC）方面主要与核浆，细胞核、胞质等有关；在分子功能（Molecular function，MF）方面主要涉及ATP 结合、酶结合、蛋白激酶活性等。根据P值分别选取BP、CC、MF 排名前10 的条目，利用R 4.0.4 软件进行可视化处理，结果见图2。经KEGG 通路注释得到28 条主要信号通路，符合P≤0.05 的通路有23 条。主要涉及肿瘤通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路和催乳激素信号通路等，见图3。

图2 潜在靶点的GO 功能富集分析图

图3 KEGG 通路富集气泡图

2.3 网络图的构建及分析

利用Cytoscape 3.7.1 软件构建“化合物—靶点—通路”网络图，见图4。其中蓝色节点代表化合物汉黄芩素，青绿色节点代表靶点，紫色节点代表通路，节点越大表明其度值越高，边代表它们之间的相互作用。通过插件CytoHubba 进行网络拓扑学分析发现，关键靶蛋白MAPK14 和MAPK8 在网络中占据的比重较大，分别调控多条通路。

图4 化合物-靶点-通路网络图

2.4 分子对接验证

从PDB 数据库下载MAPL14 和MAPK8 的三维结构，经过前期处理修饰后，通过DS 软件利用LibDOCK方法分别将MAPK14 和MAPK8 与汉黄芩素进行分子对接。为了更直观地观察MAPK14 和MAPK8 与汉黄芩素的相互作用及关键的氨基酸和基团，生成了配体-蛋白互作二维平面图，见图5。结果显示，汉黄芩素与MAPK14 通过氢键、碳氢键、π-烷基键等相互作用，汉黄芩素与MAPK8 通过碳氢键、π-烷基键相互作用，这些相互作用为化合物的结合提供了较强的静电力贡献。

图5 汉黄芩素与潜在关键靶蛋白互作二维平面图

3 讨论

呼吸道病毒是引起呼吸道感染的主要病原体。近年来，随着医疗技术的发展，人们对呼吸道病毒感染的研究不断深入[12]。目前，中药在治疗呼吸道病毒感染的临床实践中显现出了一定的效果，其研究前景广阔。有研究表明，汉黄芩素具有较强的抗病毒活性，但其具体作用机制尚不清楚[6]。本研究通过网络药理学分析共筛选出17 个汉黄芩素抗呼吸道病毒感染潜在靶点，包括MAPK14、MAPK8、BRAF、PTPN11、MET 等，且各靶点间有一定的相关性。这说明，汉黄芩素可通过作用于多个靶点来起到抗呼吸道病毒感染的作用。此外，通过分子对接技术发现，汉黄芩素可通过氢键结合在MAPK14 蛋白A 链的THR106、LEU104 上，通过π- 烷基键结合在MAPK14 蛋白A 链的Ile84、Leu75 上，通过碳氢键结合在MAPK8 蛋白A 链的Gly33 上，通过π- 烷基键结合在MAPK8 蛋白A 链的Val40、Val158 上。这表明，汉黄芩素可稳定地结合MAPK14、MAPK8，提示汉黄芩素可能是通过靶向MAPK14 和MAPK8 来发挥抗呼吸道病毒的作用。丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是p38MAPK 的重要成员之一，P38MAPK 家族是由 不 同 基 因 编 码 的α(MAPK14)、β(MAPK11)、γ(MAPK12) 和δ(MAPK13) 亚型组成，所有亚型均具有较高的氨基酸同源性[13]。其中MAPK14 是最丰富、最具特征的异构体，可参与多种生理过程和疾病[14]。研究发现，MAPK14 的磷酸化形式PMAPK14 是与索拉非尼耐药相关的一种蛋白激酶，它与乙肝病毒X 蛋白的表达有关；通过敲除pMAPK14 可提高索拉非尼的治疗效果，并可在乙型肝炎病毒（HBV）存在的情况下减轻对索拉非尼的耐药性[15]。丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）又叫JNK1 或SAPK1，是MAPK 信号通路中的重要信号分子，涉及细胞增殖、分化、凋亡等各种机制[16]。研究发现，肠道病毒71 型（EV71）感染未成熟树突状细胞（IDC）可激活JNK1/2 和p38MAPK 信号通路级联，使其下游分子c-Jun 和c-Fos磷酸化，进而可促进促炎细胞因子的分泌[17]。笔者推测，汉黄芩素可通过阻断MAPK14 和MAPK8 的活化来发挥抗呼吸道病毒的作用。本研究中通过KEGG 通路富集分析和GO 分析发现汉黄芩素抗呼吸道病毒感染的潜在靶点主要富集在肿瘤通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路等通路，主要涉及蛋白质磷酸化和信号转导等生物过程。PI3K-Akt 信号通路与细胞的增殖、凋亡等细胞进程密切相关，一些病毒的入侵和复制可能与该条通路有关[17]；MAPK 信号通路具有调节细胞的增殖、分化和生长等功能，在细胞间和细胞内的通信中发挥着重要的作用[18]。研究表明，病毒可以调节宿主细胞的信号网络，包括PI3K/AKT/mTOR 和ERK/MAPK[19-20]。本研究中分析得出的关键靶点MAPK14和MAPK8 与细胞增殖有密切的关系。

综上所述，本研究中应用网络药理学方法对汉黄芩素抗呼吸道病毒感染的潜在靶点和通路进行了分析，并结合分子对接初步验证了汉黄芩素与潜在关键靶点之间的结合活性。这揭示了汉黄芩素可通过“多靶点—多通路”的机制来起到抗呼吸道病毒感染的作用，可为后续实验设计和深入研究提供思路和参考。