2018—2020年平顶山地区非结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性分析

韦旭

平顶山市传染病医院，河南 平顶山 467000

非结核分枝杆菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)是指除麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群以外的分枝杆菌，为一种条件致病菌。其种类繁多，目前已发现约190种，大多对人体没有危害[1-2]。NTM感染后可侵犯皮肤、肺、淋巴结组织，临床上最常见的是NTM肺病。目前，NTM感染居高不下，且对许多常用抗生素耐药，已成为临床研究热点[3]。不同地区之间NTM的菌种分布及发病率差异较大，分离率差异也较大，我国东南沿海地区分离率较高，而北方内陆地区分离率较低[4]。鉴于NTM不同菌种对不同抗结核药物的敏感性不同，临床上须通过菌种鉴定及药敏试验结果合理选择药物[5]。本研究采用DNA微阵列芯片对河南省平顶山地区的NTM菌种进行鉴定，并通过药敏试验分析其耐药性，以期为治疗NTM感染相关疾病提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

选择2018年1月—2020年12月河南省平顶山市传染病医院收集的分枝杆菌阳性标本3 801份，其中检出326株NTM，分离自不同患者的标本(包括痰、尿液、支气管肺泡灌洗液等)，其中女性125例，男性201例。同一患者重复送检样本不重复计算，将首次样本送检结果纳入分析。

1.2 仪器与试剂

DNA微阵列芯片和LuxScan 10K微阵列芯片扫描仪购自北京博奥生物集团有限公司，K960 PCR仪购自力新仪器(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 NTM菌种鉴定采用DNA微阵列芯片鉴定NTM菌种。在核酸提取管中添加80 μL核酸提取液，吸取10 μL菌悬液(≥1麦氏单位浊度)至核酸提取管，振荡15 min，95 ℃加热15 min，12 000 g离心1 min，将提取的核酸于-20 ℃保存。取出聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂并融化，加至200 μL EP管，再加入2 μL DNA模板，同时设置阳性对照和阴性对照。扩增参数为：37 ℃ 600 s，94 ℃ 600 s，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 40 s，35个循环，94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10个循环，延伸420 s，4 ℃保存。在微阵列芯片的杂交盒底部添加200 μL蒸馏水，芯片正面朝上。在200 μL离心管中加入9 μL杂交混合液，再加入6 μL PCR产物，总体积为15 μL，95 ℃反应5 min，于冰上静置3 min，加入13.5 μL杂交反应混合物，50 ℃孵育2 h，用芯片洗涤液洗涤。最后用微阵列芯片扫描仪扫描，探针信号值≥参考值时判定为阳性，信号值<参考值时判为阴性。

1.3.2 药敏试验在改良罗氏基础培养基中添加溶解的抗结核药物，分装于试管内，置于85 ℃倾斜放置50 min。37 ℃试培养24 h后，如无细菌生长，置于 4 ℃保存。药物浓度如下：异烟肼为1 μg/mL和10 μg/mL，链霉素为10 μg/mL和100 μg/mL，利福平为50 μg/mL和250 μg/mL，左氧氟沙星为1 μg/mL 和10 μg/mL，阿米卡星为10 μg/mL和100 μg/mL，乙胺丁醇为5 μg/mL和50 μg/mL，对氨基水杨酸为1 μg/mL和10 μg/mL，丙硫异烟胺为25 μg/mL和100 μg/mL，卡那霉素为10 μg/mL和100 μg/mL。

药敏试验过程：用接种环取生长至对数期的细菌培养物，采用细菌超声分散计数仪将细菌超声分散，用生理盐水稀释，与1号麦氏比浊管比较，配制成密度为1麦氏浊度的菌液。然后，用生理盐水将菌液10倍连续稀释成密度为1×10-2、1×10-4麦氏浊度的菌液，吸取10 μL菌液接种至含有药物的培养基斜面，37 ℃培养4周，根据《全国临床检验操作规程》判定分枝杆菌药敏结果。

2 结果

2.1 NTM感染患者的年龄分布

NTM感染患者的年龄分布见表1。无论男女，从61～80岁患者分离得到的NTM菌株最多，其次是41～60岁患者。

表1 NTM菌株来源(n)

2.2 DNA微阵列芯片结果

利用DNA微阵列芯片对分离的NTM菌株进行鉴定，结果如表2所示。共鉴定出8个菌种，胞内分枝杆菌分离率最高，占35.28%；其次是龟/脓肿分枝杆菌，分离率为24.85%；其他依次为鸟分枝杆菌18.40%，堪萨斯分枝杆菌12.58%，偶然分枝杆菌5.21%，浅黄分枝杆菌1.53%，戈登分枝杆菌1.23%，瘰疬分枝杆菌0.92%。

表2 NTM菌种鉴定结果

2.3 NTM总体耐药情况

NTM总体耐药情况如表3所示。NTM对异烟肼的耐药率高达97.85%，对链霉素、利福平、左氧氟沙星、阿米卡星、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺、卡那霉素的耐药率分别为84.66%、76.38%、54.60%、73.01%、73.62%、86.81%、29.75%、77.61%。

表3 NTM总体耐药情况

2.4 NTM不同菌种的耐药情况

NTM不同菌种的耐药情况如表4所示。除戈登分枝杆菌对异烟肼的耐药率为75%外，胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌对异烟肼的耐药率均>94%，其中浅黄分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌对异烟肼的耐药率高达100%。龟/脓肿分枝杆菌对利福平的耐药率为100%，戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌对利福平的耐药率较低，分别为25.00%和41.46%，其余菌种对利福平的耐药率介于60%～77%。除堪萨斯分枝杆菌外，其他NTM菌种对链霉素的耐药率均>50%，其中龟/脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌对链霉素的耐药率>90%。堪萨斯分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、鸟分枝杆菌对乙胺丁醇的耐药率较低，而胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌对乙胺丁醇的耐药率较高，均>90%。胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌对左氧氟沙星的耐药率分别为60.87%、88.89%，其他NTM菌种对左氧氟沙星的耐药率均<50%，其中堪萨斯分枝杆菌对左氧氟沙星的耐药率最低，仅为7.32%。龟/脓肿分枝杆菌对阿米卡星的耐药率较高，而浅黄分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌对阿米卡星的耐药率较低。胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、偶然分枝杆菌对对氨基水杨酸的耐药率较高，瘰疬分枝杆菌对对氨基水杨酸的耐药率较低。偶然分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌对丙硫异烟胺的耐药率>50%，其他NTM菌种对丙硫异烟胺的耐药率均<50%。龟/脓肿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌对卡那霉素的耐药率>90%，而戈登分枝杆菌、浅黄分枝杆菌对卡那霉素的耐药率为0。

表4 NTM不同菌种的耐药情况(n，%)

3 讨论

NTM是指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌之外的分枝杆菌的总称，其曾用名很多，包括机会性分枝杆菌、非典型分枝杆菌、野种分枝杆菌、未分类分枝杆菌、副结核杆菌等。目前共发现14个亚种，多数为寄生菌，仅少数可致病，属于条件致病菌[6]。近年来，结核病得到了有效控制，但NTM的分离率并不乐观，其诱发的肺组织疾病受到全球的广泛关注[7]。NTM在灰尘、土壤、水等自然环境中广泛存在，有些对重金属、消毒剂耐受，导致饮用水中也可能存在NTM，人主要从环境中获得感染[8]。NTM患者个体和区域之间有明显的差异表型。苏州地区鉴定的NTM中，胞内分枝杆菌占比高达57.20%；其次为堪萨斯分枝杆菌，占比为25.00%；此外还分离出草分枝杆菌。徐州市分离的胞内分枝杆菌占比为42.86%，其次为鸟分枝杆菌。天津市分离的胞内分枝杆菌占比只有29.08%，分离的浅黄分枝杆菌占比最低。NTM种类较多，分离率逐年上升，很多NTM病的临床表现与肺结核极为相似，只有通过分离鉴定NTM菌株，分析其耐药性，才能提高临床治疗的效果[9-11]。

NTM感染的发病率与年龄相关，随着年龄的增加，其发病率逐渐上升。在中国，男性NTM感染的发病率高于女性[6]。本研究分离的326株NTM分别来自201例男性和125例女性，男性明显多于女性，且61～80岁患者明显多于≤60岁患者。

随着分子生物学的发展，新的菌种不断被发现，亲缘关系也逐渐被鉴定，使得NTM的分类更加细化。例如：脓肿分枝杆菌复合群由3个亚群组成，分别为脓肿分枝杆菌、马赛分枝杆菌、博莱分枝杆菌。鸟型分枝杆菌复合群亚种最多，包括胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、马萨分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、伤口分枝杆菌等[6]。本研究采用DNA微阵列芯片分析于河南地区分离获得的326株NTM，共鉴定出8个菌种，其中胞内分枝杆菌占比最高，分离率为35.28%，其次是龟/脓肿分枝杆菌。对天津地区NTM菌种分布的调查也发现，胞内分枝杆菌的分离率最高，其次为龟/脓肿分枝杆菌[11]，与本研究结果一致。大理地区NTM菌种分布中，临床分离率最高的为鸟分枝杆菌，其次为脓肿分枝杆菌[12]。本研究分离鉴定结果也符合河南省2013——2018年NTM的流行特征[13]，虽然分离率有差距，但总体趋势一致，均为胞内分枝杆菌占比最高。

NTM对常见抗结核类药物的耐药性极高[14-15]。本研究中，NTM对异烟肼的耐药率高达97.85%，对链霉素、利福平、左氧氟沙星、阿米卡星、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺、卡那霉素的耐药率分别为84.66%、76.38%、54.60%、73.01%、73.62%、86.81%、29.75%、77.61%，仅对丙硫异烟胺的耐药率较低。秦中华等[16]报道了339株NTM，对异烟肼的耐药率最高，为96.9%，与本研究的结果基本一致。吴海良等[17]也报道NTM对利福平的耐药率为70%，对异烟肼的耐药率为97.5%，对阿米卡星的耐药率为70%，表明NTM对异烟肼、利福平等抗结核药物有极高的耐药性，而对既往认为耐药性较低的阿米卡星的耐药性明显上升。本研究的药敏结果还显示，除戈登分枝杆菌外，其余NTM菌种对异烟肼的耐药率均>94%；分离率较高的龟/脓肿分枝杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇耐药率均>95%。NTM对丙硫异烟胺的总耐药率较低，这对NTM病的治疗具有指导意义。目前，虽然针对某些NTM有推荐的药敏试验方法及药物临界浓度，但仅经过为数不多的临床病例评价，且体外药敏试验结果与临床效果的关系尚不明确，比较明确的是阿米卡星耐药与鸟型分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌感染治疗失败有关[6]。本研究也发现，龟/脓肿分枝杆菌对阿米卡星的耐药率为97.53%，胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌对阿米卡星的耐药率分别为76.52%和61.67%。

NTM种类较多，且新的菌种不断被发现，随着分子生物学的发展，亲缘关系亦逐渐被鉴定。但NTM对常见的抗结核类药物的耐药性极高，因此临床治疗NTM病时，应尽量通过菌株鉴定及药敏试验结果选择合适的药物，同时亟须研发新的抗NTM药物，这对后续提高治疗效果有重要的意义。