中性粒细胞胞外诱捕网在ANCA相关性血管炎发病机制中的作用

高璇，林江涛

ANCA相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)是一种伴随血清ANCA存在的系统性小血管炎。这组疾病包括显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)、肉芽肿性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis，GPA)、嗜酸性肉芽肿性血管炎(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis，EGPA)。AAV患病率为300/100万～421/100万，且存在明显的地域差异。欧洲国家以GPA为主，东亚国家以MPA为主。种族之间差异较大，其中白种人发病率最高。目前AAV的主要治疗手段还是以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，而长期使用激素及免疫抑制剂可引发骨质疏松、严重感染、增加肿瘤风险等不良事件。因此寻找新的治疗手段，对于AAV患者的治疗和管理有重要意义。研究表明，中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是AAV自身抗原的来源之一，NETs调控紊乱可诱导自身抗体产生，加重AAV疾病的严重程度。因此，NETs可能成为治疗AAV的潜在靶点。本文就NETs生物学特性、NETs在AAV机制中的作用以及NETs靶向治疗AAV的价值进行综述。

1 NETs生物学特性

NETs是由组蛋白和细胞质颗粒蛋白组成的细胞外DNA网状结构。其DNA细丝的直径为15～17 nm，镶嵌在DNA细丝上的蛋白质为直径约为25 nm的球状结构。NETs的主要蛋白质成分是组蛋白，其中核心组蛋白为H2A、H2B、H3和H4，占NETs相关蛋白质的70%，其次是颗粒酶和多肽，包括中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、组织蛋白酶G、白细胞蛋白酶3等，这些蛋白与抗菌活性相关，参与细菌、真菌、寄生虫感染过程。

NETs形成过程称为NETosis。NETosis可引起呼吸爆发，是继细胞凋亡、坏死等之外的一种新的细胞死亡方式。中性粒细胞受到白细胞介素- 8(interleukin- 8，IL- 8)、12-豆蔻酸- 13-乙酸佛波醇(phorbol- 12-myristate- 13-acetate，PMA)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等刺激后，核内染色质开始解聚，该过程由肽基精氨酸脱亚酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)介导，PAD4催化组蛋白中的精氨酸转化为瓜氨酸，减少组蛋白的强正电荷，从而减弱组蛋白-DNA的相互作用，进而加速染色质解聚。除了PAD4，中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)也在NETs形成过程中起重要作用，NE通过裂解组蛋白H4，促进染色质解聚。随着核膜和颗粒膜分离并消失，解聚后的DNA、瓜氨酸化的组蛋白以及颗粒蛋白共同组成NETs，最后被排出细胞外。

NETosis又可分为两个循序渐进的阶段：早期致命NETosis和晚期自杀性NETosis。早期致命NETosis由金黄色葡萄球菌感染通过补体受体和Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)诱导形成，或由大肠杆菌感染直接或间接通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)活化诱导形成，从而发挥吞噬和趋化作用；晚期自杀性NETosis由胆固醇晶体诱导形成，可与巨噬细胞表面蛋白(例如αvβ3，CD14，CD36)结合形成动脉粥样硬化斑块，导致动脉粥样硬化，心肌梗死和中风等疾病发生。这表明，NETosis在不同的发生阶段起到不同的作用，NETosis是一把双刃剑，既可以在先天性免疫防御中起到重要的生理作用，又可以促进炎症及自身免疫疾病的发生发展。

NETs结构包含多种可以成为自身抗原的组分，各组分间的分子间作用力限制了自身抗原对机体的伤害。但是，如果NETs生成过度活跃或清除机制出现异常，其也可能对机体产生伤害，并参与多种自身免疫病的致病过程。例如系统性红斑狼疮、AAV、类风湿关节炎等疾病。

2 NETs在AAV发病中的作用

中性粒细胞表面自身抗原暴露后与被激活/损伤的内皮细胞相互作用，导致细胞裂解，形成NETs。ANCA可通过肿瘤坏死因子-α，脂多糖，或补体因子5a等细胞因子激活中性粒细胞脱颗粒，产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，释放DNA染色质形成NETs。这些细胞因子通过诱导内皮选择素的表达，使中性粒细胞在血管内及细胞间迁移，增加中性粒细胞表面自身抗原的表达，如髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蛋白酶 3(proteinase 3，PR- 3)和其他中性粒细胞颗粒蛋白。随之，ANCA与自身抗原结合形成可溶性免疫复合物，自身抗体的Fc部分与FcgRs结合，最终导致中性粒细胞激活，驱动MPO、NE和PR3脱颗粒，核小体染色质从细胞中解聚并排出，导致NETs形成，最终导致中性粒细胞死亡。从而导致小血管坏死性炎症，内皮细胞死亡、血管通透性增加、纤维蛋白沉积，随后引起单核细胞和巨噬细胞募集，最终演变为肉芽肿。

如前所述，NETs是中性粒细胞介于凋亡与坏死之间的一种程序性死亡方式，NETs的形成和分解受到严格控制，过量暴露的NETs会损伤血管内皮细胞，导致血管病变，参与AAV疾病的发生发展。体外研究及动物实验均进一步证明了NETs可诱导ANCA生成，参与AAV疾病的病理过程：(1)AAV患者的肾活检样本以及皮肤和血栓样本中可检测到NETs的存在。Kessenbrock等研究发现在ANCA-IgG孵育的中性粒细胞中观察到活跃的NET形成，但在与对照组IgG孵育的中性粒细胞中没有观察到NET的形成。(2)AAV患者的中性粒细胞比健康献血者的中性粒细胞更容易自发释放NETs。中性粒细胞亚群中的低密度中性粒细胞(Low density granuloctyes，LDGs)已被证明能够自发释放NETs，明显多于正常密度中性粒细胞，这些LDGs被认为是AAV中NETs的主要来源。(3)Sangaletti等发现将被NETs激活的骨髓来源树突状细胞(Marrow-Derived Dendritic Cells，MDCs)注射到幼稚小鼠体内可诱导ANCA形成。该机制为NETs增强MDCs对PR3和MPO分子的摄取，从而激活自身反应性B细胞，诱导ANCAs的生成。(4)NETs的内容物会破坏对特定自身抗原的耐受性，MPO和PR3等自身抗原通过树突细胞提呈给CD4+T细胞，诱导B细胞分化成浆细胞，通过产生IL- 21最终导致ANCA产生。(5)NETs还可以TLR- 9依赖的方式激活pDC和自身反应性B细胞。激活的pDC分泌干扰素-α和IL- 8，进一步诱导NETs的过度激活，而激活的B细胞可产生ANCA。(6)NETs中的内源性抗菌肽LL37可激活浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid Dendritic Cells，pDCs)，pDCs激活后产生大量干扰素(IFN)-α、caspase- 1和炎症分子，LL37的高表达与AAV全身和肾脏炎症有关。这些研究表明NETs主要来源于LDGs，其组成成分可作为AAV中的自身抗原，并通过多种途径诱导ANCA的生成，在AAV的发病机制中起重要作用。

反之，ANCA和其他体液因子(如损伤相关的分子模式)会进一步诱导NETs形成，在发病机制中形成NETs-ANCA恶性循环。(1)高迁移率基团蛋白1(High Mobility Group Protein 1，HMGB1)参与ANCA诱导NETs形成。HMGB1可通过增加ANCA抗原易位来启动中性粒细胞，从而激活NETs，促进ANCA介导的呼吸爆发和脱颗粒。研究表明，HMGB1通过TLR2、TLR4和RAGE途径以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶依赖性方式增加NETs的释放。(2)Tang等实验数据表明，ANCA可通过溶酶体膜相关蛋白2诱导中性粒细胞自噬，从而促进NETosis，过度的NETs暴露损伤血管内皮细胞，导致炎症发生。

综上所述，外源性抗原(如药物或微生物等)及自身抗原(产生变异或细胞内成分)的过度暴露可导致无致病性的天然ANCA在基因、环境的作用下转化为致病性的ANCA，可引起中性粒细胞裂解死亡形成NETs导致血管损伤。NETs又可以通过免疫耐受性丧失激活ANCAs。在发病机制中形NETs-ANCA恶性循环。因此，ANCA可诱导NETosis过程损伤血管内皮细胞引起血管炎，NETs的过度激活又可诱导ANCA的产生，彼此形成恶性循环。ANCA与NETs相互作用，互为因果，是导致AVV发生发展两个重要因素。

3 靶向NETs治疗AAV

AAV的治疗分为诱导缓解与维持缓解2个阶段。糖皮质激素和免疫抑制剂仍为治疗AAV的主要方法，但激素及免疫抑制治疗可增加机会性感染和恶性肿瘤的易感性。随着人们对AAV发病机制的深入研究，中性粒细胞、B细胞、T细胞、细胞因子和补体等成分在AAV发病机制中都起了关键作用，针对以上靶点，已有相关药物进入临床及临床试验。但目前还没有专门针对NETs靶点的治疗方法。通过阻断NETs形成，或者通过DNase酶降解NETs，可治疗NETs水平过高所致的相关疾病。利用现代生物技术，制备针对NETs或者NETs组分的特异性配体，有助于治疗中性粒细胞炎症性疾病。因此，研发以NETs为靶点的药物，有望为治疗自身免疫疾病等非感染性疾病带来新的愿景。

目前，已有针对NETs为靶点的药物在体内实验及AAV动物模型中进行研究。CI-amidine作为新的靶点药物是一种PAD4抑制剂，PAD4在NETosis中起着关键作用。Rao等证明在MPO-ANCA小鼠模型中证明PAD抑制剂可以通过降低组蛋白瓜氨酸化减少NETs的形成，改善血管功能，降低血清MPO-ANCA水平，抑制血管炎发病。

2010年NE首次被证明能与MPO协同工作，溶解核膜并帮助裂解组蛋白。最近的研究表明，GSDMD和NE也有协同作用，破坏核膜和细胞膜，再次强调了NE在NETs形成中的重要性。针对NE为靶点的两个药物为Alvelestat和Bay85- 8501。Alvelestat是第三代NE抑制剂，在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征小鼠模型中，Alvelestat已有效抑制了NETosis，并显著降低炎症反应。Bay 85- 8501是第五代NE抑制剂，与前一代抑制剂相比，它的安全性及有效性更强。在体外试验中，观察到Bay85- 8501有效减少了NET的形成。这两种药物在治疗呼吸道疾病的临床试验中都被证明良好的安全性和耐受性，已成为阻断AAV中NETs形成的候选药物。在MPO-ANCA相关性血管炎(MPO-ANCA-associated vasculitis，MPO-AAV)小鼠模型中使用Alvelestat和BAY 85- 8501抑制NETs形成取得了良好的效果，证明能够减少肾小球NETs积聚和MPO沉积从而减少肾小球损伤，减少肾小球CD4 T细胞、CD8 T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的聚集，从而抑制了MPA的发展及肾脏损害。且经Bay85- 8501处理的小鼠ANCA滴度显著降低。

磷脂酰肌醇3激酶γ(Phosphatidylionsitol 3-kinaseγ，PI3K-γ)能增强T细胞活动，增加IL- 17水平，参与ANCA的自身免疫反应。PI3K-γ的基因消融可减少NETosis和ANCA的产生。在MPA模型小鼠中应用PI3k-γ特异性抑制剂进行治疗，结果显示MPA小鼠模型中的ANCA滴度、肾和肺损伤的严重程度均降低，表明通过PI3K-γ阻断抑制体内NETosis可有效改善MPA，从而阻止肾脏和肺损伤。Kimura等研究揭示了通过阻断PI3K-γ可抑制NETosis，进而阻止ANCA的产生，从而阻止肾和肺损伤。目前已有PI3K-γ抑制剂有效地改善了类风湿关节炎动物模型的症状，PI3K-γ/δ双重抑制剂已经在肿瘤和哮喘疾病中开展了1- 3期临床试验。Schreiber 等报道了ANCA通过RIPK1/3和依赖混合系激酶结构域样(mixed-lineage kinase domain-like，MLKL)坏死性凋亡诱导NETs的形成。目前RIPK1抑制剂处于第二期临床试验中，用于治疗炎症性肠道疾病、牛皮癣、类风湿关节炎等疾病。由此可见，通过抑制PAD4、NE、PI3K-γ、RIPK1的生成可有效减少AAV患者中NETs的产生，可成为AAV潜在的治疗靶标。

NETs主要通过血清中的脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)降解；然而自身免疫病患者体内普遍存在DNase水平或活性降低的现象，因此可以在体内持续存在。Schreiber等在AAV模型中证实DNase I可抑制ANCA诱导的NETs形成、减少肾小球损伤，延展疾病发展。通过给予外源性DNase I以加速NETs的降解，可能会缓解疾病的发展，但由于DNase I半衰期短，治疗仍存在困难。腺病毒相关载体(adeno-associated virus vectors，AAVec)可以持续传递DNase I为AAV提供一次性治疗。目前，AAVec技术已经成功地用于治疗人类失明、凝血障碍和神经肌肉疾病。因此，AAVec技术有望用于治疗AAV。总之，NETs的生成与降解在AAV发病机制中起着重要作用，通过抑制NETs的激活或促进其降解为AAV治疗提供新的方向。

综上所述，NETs在AAV中的作用已在临床样本和动物实验中得到了验证，NETs作为治疗靶点的研究也得到广泛开展。进一步探索NETosis的相关途径，以及NETs参与ANCA形成的分子信号通路，对阐明自身免疫性疾病的发病机制，以及发现新的临床治疗手段具有重要意义。今后需要更多的基础研究和临床试验证实，以期为AAV治疗方案和特异性靶点药物的开发提供新的思路，以便为疾病治疗提供更有针对性的指导。