乳腺癌患者循环外泌体miR-9与E-cadherin表达及腋窝淋巴结转移的关系*

符传超，陆裕富，文钦夫

（文昌市人民医院心胸甲乳外科，文昌 571300）

乳腺癌前哨淋巴结活检术（SLNB）在上世纪90年代首次被报道为腋窝淋巴结分期技术，并逐渐成为评估腋窝淋巴结（ALN）状态的金标准[1]。SLNB存在淋巴水肿、肩关节活动度受损等问题，甚至辐射暴露风险。有研究证实，在平均8年的随访期内，前哨淋巴结阴性患者的区域淋巴结复发率极低（0.4%）[2]。因此，临床上急需寻找一种侵入性更小的方法来评估术前ALN 状态，并安全地避免在无ALN 转移的患者中使用SLNB，这将有助于改善患者的身体状况，同时保持高无复发率和总体生存率。

miRNA 是一种小的非编码RNA，通过与特定基因的30 个未翻译区域结合来调节基因表达[3]，并在循环外泌体中稳定存在[4]。血清外泌体miRNA是检测乳腺癌的潜在生物标志物[5-7]。有研究表明，miR-9 在乳腺癌细胞中的表达上调，其靶向编码E-钙黏连蛋白（E-cadherin）的信使RNA，导致细胞运动性和侵袭性增加[8-9]。然而缺乏相关的临床证据证实血清外泌体miR-9 在预测乳腺癌患者ALN 状态中的价值。本研究回顾性分析了169例乳腺癌患者的临床资料，旨在分析血清外泌体miR-9 与组织E-cadherin表达及ALN转移的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2018 年1 月至2021 年12月在本院乳腺外科和肿瘤科接受手术的169例原发性乳腺癌患者的临床资料，年龄28～103岁，平均（51.95±10.71）岁。病例纳入标准：（1）女性单侧原发性乳腺浸润性导管癌（IDC）[10]，诊断时无远处转移；（2）行乳腺切除术或保乳手术，以及ALN 清扫（ALND）；（3）术前无新辅助治疗；（4）病理检查确定肿瘤已完全切除，且无其他器官恶性肿瘤。排除标准：（1）男性乳腺癌；（2）继发性乳腺癌；（3）双侧乳腺癌（同步或异时）；（4）未行ALND 的前哨淋巴结（SLN）转移患者，未行SLNB的患者，以及肿瘤亚型尚不明确的患者。每3个月电话随访1次。另选取同期在本院行体格检查的健康志愿者150例作为对照组，年龄31～85岁，平均（55.03±10.40）岁，对照组与乳腺癌患者年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 循环血清外泌体的提取与鉴定 术前采集乳腺癌患者的静脉血，1 500 r/min 离心10 min，再以20 000 r/min离心10 min，收集上清液，保存在-80 ℃冰箱中。按照总外泌体分离试剂盒（美国Invitrogen公司）说明书操作，将60 µL 外泌体分离试剂加入300µL 血清样本中，涡流混合，4 ℃下静置30 min，室温下12 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，重悬于100µL磷酸盐缓冲液中。外泌体样品用1%戊二醛固定，并放入碳涂层铜网格中，将草酸铀酰溶液（pH 7.0）覆盖在网格上5 min。使用Tecnai G2 透射电镜观察外泌体形态，ZetaView纳米颗粒追踪仪确定外泌体的大小。通过Western blotting法检测CD9和CD81 外泌体标记膜蛋白。CD9 和CD81 抗体均购自英国Abcam公司。

1.3 RT-qPCR 法检测血清外泌体miR-9 表达 使用miRcute miRNA 分离试剂盒（中国北京天根）从外泌体中提取miRNA。使用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（日本TaKaRa）对提取的miRNA进行反转录。使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂（日本TaKaRa）进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸32 s，共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-9相对表达量。

1.4 免疫组化法检测乳腺癌组织中E-cadherin 表达 乳腺癌组织以10%甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋，制备4 μm厚连续切片，按照E-cadherin免疫组化试剂盒说明书检测乳腺癌组织中E-cadherin蛋白表达。E-cadherin单克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司。显微镜下随机选取5个视野，E-cadherin以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，计算阳性细胞所占百分比，阳性细胞百分比≥10%为阳性，＜10%为阴性[11]。

1.5 统计学方法 使用SPSS 26.0统计软件处理数据，非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以百分率表示，率的比较采用χ2检验；采用多因素Logistic回归分析方法分析影响乳腺癌患者ALN转移的独立危险因素，受试者工作特征（ROC）曲线分析循环外泌体miR-9表达预测乳腺癌患者ALN 转移的临床价值，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 循环血清外泌体获取及鉴定 透射电镜下可见囊泡呈圆形，直径30～150 nm（图1A）。纳米颗粒追踪显示囊泡的平均直径为100 nm，浓度约为2.5×107个/mL（图1B）。Western blotting 显示，CD9和CD81表达于分离的囊泡上（图1C）。结果表明从血清中分离的囊泡为外泌体。

图1 循环血清样本中分离的外泌体鉴定

2.2 乳腺癌患者血清外泌体miR-9 表达 乳腺癌患者血清外泌体miR-9 表达水平为1.21（1.04～1.94），高于对照组的0.97（0.79～1.16）（Z=-7.226，P＜0.001）。

2.3 乳腺癌组织与癌旁组织中E-cadherin 表达比较 乳腺癌组织中E-cadherin 阳性表达率为37.87%，显著低于癌旁组织的67.46%（χ2=29.671，P＜0.05，n=64），见图2。

图2 组织中E-cadherin表达情况（×200）

2.4 乳腺癌患者血清外泌体miR-9 表达与E-cadherin表达的关系 E-cadherin表达阳性患者血清外泌体miR-9 表达水平为1.04（0.94～1.57），低于Ecadherin表达阴性患者的1.35（1.17～2.24）（Z=-5.993，P＜0.001）。

2.5 乳腺癌患者血清外泌体miR-9 水平与临床病理特征的关系 根据血清外泌体miR-9 表达中位值，将乳腺癌患者分为miR-9 低表达组（≤1.21）和miR-9 高表达组（＞1.21）。乳腺癌患者血清外泌体miR-9 表达水平与年龄、分子亚型、组织学分级、有无血管侵犯、有无神经浸润无关（P＞0.05），与肿瘤最大直径、AJCC 临床分期、TNM 分期、有无淋巴管侵犯、E-cadherin 表达、ALN 转移有关（P＜0.05），见表1。

表1 乳腺癌患者血清外泌体miR-9表达与临床病理特征的关系n（%）

2.6 乳腺癌患者ALN 转移的影响因素分析 无ALN转移组与有ALN转移组患者年龄、分子亚型、组织学分级、神经浸润比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组肿瘤最大直径、AJCC 临床分期、血管侵犯、淋巴管侵犯、E-cadherin表达及外泌体miR-9 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。将上述差异有统计学意义的变量进一步纳入多因素Logistic 回归分析中，结果显示：AJCC 临床分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴管侵犯、血清外泌体miR-9表达水平升高均为乳腺癌患者ALN转移的危险因素（均P＜0.05），见表3。

表2 影响乳腺癌患者ALN转移的单因素分析结果n（%）

表3 影响乳腺癌患者ALN转移的多因素Logistic回归分析结果

2.7 血清外泌体miR-9水平与ALN转移的关系 ALN 转移患者血清外泌体miR-9 表达水平为1.54（1.00～2.00），显著高于无ALN转移患者的0.91（0.78～0.98）（Z=-8.011，P＜0.001）。血清外泌体miR-9 表达预测乳腺癌患者ALN 转移的AUC 为0.859（95%CI：0.805～0.913），对应截断值为1.00，特异度为81.3%，灵敏度为75.5%，见图3。

图3 血清外泌体miR-9 表达对乳腺癌患者ALN 转移的预测价值

3 讨论

本研究发现，ALN 转移患者血清外泌体miR-9表达水平显著高于无ALN转移患者，提示术前血清外泌体miR-9水平升高与ALN转移有关。此外，乳腺癌组织E-cadherin 表达与外泌体miR-9 表达呈负相关关系，提示循环外泌体miR-9 可能通过miR-9/E-cadherin轴依赖性机制影响BC淋巴结转移。

miR-9可通过直接结合靶基因在转录后抑制基因表达促进乳腺癌发生、发展[8]。miR-9的表达可被致癌转录因子MYC 激活，通过直接靶向关键的转移抑制蛋白E-cadherin 来提高细胞运动性和侵袭性[9,12]。E-cadherin 低表达激活β-catenin 信号，促进血管内皮生长因子表达，导致肿瘤血管生成，并使肿瘤细胞对肿瘤微环境产生的上皮—间质转化（EMT）诱导信号敏感，导致肿瘤细胞更容易扩散和转移[13]。研究显示，miR-9 能通过转录后调节STARD13 表达促进乳腺癌EMT 和转移[14]。除了通过抑制靶向基因促进乳腺癌细胞转移外，miR-9 还可以介导竞争性内源RNA 来参与癌细胞转移[8]。miR-9 可与肿瘤抑制基因叉头框蛋白O1（FOXO1）和E-cadherin-3’非翻译区结合，FOXO1 和E-cadherin-3’非翻译区之间存在miR-9 的竞争，因此FOXO1 3’非翻译区通过miR-9 介导的竞争性内源RNA机制诱导E-cadherin表达来抑制乳腺癌细胞转移[9]。致癌基因CYP4Z1 3'非翻译区也可通过与Ecadherin 竞争性结合miR-9 而抑制乳腺癌细胞的迁移和EMT[15]。有研究发现，miR-9 的下游效应子白血病抑制因子受体通过触发Hippo通路导致转录共激活因子YES相关蛋白的磷酸化、细胞质滞留和功能失活，进而抑制乳腺癌细胞转移[16]。以上研究提示miR-9 可以通过不同的机制诱导乳腺癌细胞转移，其可能为浸润性乳腺癌的潜在治疗靶点。

研究发现，肿瘤来源的外泌体携带反映起源癌细胞遗传或信号改变的物质，通过将miRNA和蛋白质转移到正常组织参与肿瘤转移过程[7]。Kia 等[17]发现，乳腺癌细胞株MDA-MB-231通过外泌体传递miR-9增强低侵袭转移性细胞株MCF-7侵袭和迁移能力。在乳腺癌远处转移灶中发现miR-9表达水平显著高于相应的原发性肿瘤[18]。miR-9通过调控Ecadherin表达影响细胞侵袭性，miR-9过表达与乳腺癌患者的淋巴结转移有关[19]。这些结果表明miR-9为调控乳腺癌转移的重要因子。本研究中，ALN转移患者的血清外泌体miR-9水平高于无淋巴结转移患者，提示miR-9 参与了乳腺癌的淋巴结转移；Ecadherin 表达阳性患者血清外泌体miR-9 表达水平显著低于E-cadherin表达阴性患者，较高的miR-9表达与E-cadherin低表达之间存在显著关联。因此推测循环外泌体通过miR-9/E-cadherin 轴依赖性机制影响乳腺癌淋巴结转移。

综上，乳腺癌患者血清外泌体miR-9 高表达可能在ALN转移中发挥重要作用，且miR-9高表达可能通过调节E-cadherin 来实现乳腺癌细胞转移，因此检测血清外泌体miR-9 可能有助于术前诊断ALN转移。