谷子NCED3基因克隆及生物信息学和表达模式分析

王艳珂，黎飞飞，陈二影，杨延兵，管延安，高文伟，秦岭

(1.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.山东省农业科学院作物研究所，山东 济南 250100)

脱落酸(abscisic acid，ABA)是植物五大天然生长调节剂之一，能参与植物响应多种逆境胁迫如干旱、冷害、盐害等的生理反应和分子生物学效应[1]，且能诱导植物产生对不良环境的抗性(抗旱性、抗寒性、抗病性、耐盐性等)，是植物的“抗逆诱导因子”[2，3]。植物体内ABA的形成有直接和间接两种途径，现在越来越多的证据表明高等植物主要以间接途径合成ABA[4]。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)通过剪切9-顺式新黄质和9-顺式紫黄质促使ABA前体黄质醛形成，是ABA生物合成途径中的关键限速酶[5]。NCED基因不仅是启动ABA积累的直接因素，也是控制ABA合成、影响合成ABA信号强度的重要因素。

在玉米中鉴定到的VP14基因是第一个被发现的NCED基因[6]，随后在其它植物如烟草[7，8]、大豆[9]、柱花草[10]、马铃薯[11]、草莓[12]等中也克隆到了NCED基因。在拟南芥中最先完成了NCED基因家族的鉴定工作，目前已从中鉴定出9个NCED基因[13]，其中有5个与ABA合成相关(AtNCED2，AtNCED3，AtNCED5，AtNCED6，At-NCED9)。从水稻中鉴定到5个NCED基因家族成员(OsNCED1，OsNCED2，OsNCED3，OsNCED4，OsNCED5)，其中，OsNCED1与水稻的耐旱能力相关，OsNCED2的表达水平与延迟种子萌发有关，OsNCED3可调节水稻在干旱环境中的ABA水平和抗逆性，OsNCED4影响水稻的结实率与产量[14]。在其它植物中也发现NCED受逆境胁迫诱导表达，如ABA和低温胁迫均能诱导茶树的CsNCED1基因显著上调表达[15]；高盐、低温、干旱、外源ABA、NAA处理均可不同程度地诱导GmNCED1在大豆叶片及根中表达[16]；干旱、高盐、低温和高温4种非生物胁迫可不同程度地诱导GmNCED5的表达[17]；PmNCED1的表达量随着糜子受PEG胁迫时间的延长而升高[18]。但NCED基因的表达模式因物种和胁迫处理的不同而具有明显差异。

长期以来，模式植物拟南芥和水稻在引领重要科学发现和先进研究技术方面扮演着十分重要的角色。然而，拟南芥和水稻都是C3植物，在作为C4禾谷类作物的模式植物时有很大的局限性。谷子具有抗旱、耐瘠薄和高光效等突出优势[19]，恰恰弥补了拟南芥和水稻作为模式植物的不足，是极具发展潜力的C4禾谷类模式植物[20]。但目前关于谷子NCED基因及其差异表达分析的研究报道甚少。本研究从谷子品种济谷22中克隆获得SiNCED3，并对其进行生物信息学分析，同时通过实时荧光定量PCR分析其在谷子不同组织及不同胁迫处理下的表达差异，以期为深入探究SiNCED3的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料处理及样品采集

供试谷子品种为山东省农业科学院作物研究所育成的济谷22。

2021年4月于光照培养箱内进行谷子幼苗培养，设置温度25℃、光照/黑暗16 h/8 h、光强8 000 lx，待幼苗长至四叶期时，一部分取地上部分样品，液氮速冻后放-80℃超低温冰箱保存，用于SiNCED3的克隆；一部分进行逆境胁迫处理。

共设置3种逆境胁迫处理:干旱处理，于培养液中加入20%(w/v)PEG-6000模拟干旱；盐胁迫处理，于营养液中加入120 mmol/L NaCl；4℃低温处理。以正常培养为对照。分别在处理0、3、6、12、24、48 h取地上部分样品，做好标记，液氮速冻后放-80℃超低温冰箱保存，用于基因表达分析。以上试验均进行3次生物学重复。

2021年6月在大田种植的济谷22开花期前，取根、茎、叶、叶鞘、穗，液氮速冻后放-80℃超低温冰箱保存，用于SiNCED3在不同组织中的表达分析。

1.2 总RNA的提取及反转录

将-80℃保存的不同试验材料置于研钵中用液氮研磨成粉后，按照植物基因组总RNA提取试剂盒(SparkJade)的说明书进行提取，之后采用1%琼脂糖凝胶检测，使用cDNA反转录试剂盒(TaKaRa)将RNA反转录为cDNA，用于基因克隆及实时荧光定量PCR。

1.3 SiNCED3基因全长克隆

根据Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)公布的谷子NCED基因序列(Seita.9G156500)设计引物(F:5′-ATGGCGATGCTTGTTCGGGGTCTCGCTCCGCCGCCCACCTCTGTTTCTT CCATACACC-3′；R:5′-CTACGAGTCCTCACGTGGAGGTAGGTGGGGAAC-3′)，由上海生工生物工程股份有限公司合成，然后以反转录的济谷22 cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系总体积50 μL，包括2×PCR Buffer for KOD FX 25.0 μL，2 mmol/L dNTP 10.0 μL，Primer F、R各1.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 10.0 μL，KOD FX 1.0 μL。将各组分清弹混匀，短暂瞬时离心收集于离心管底，将离心管置于PCR仪中进行扩增。反应程序为:94℃2 min；98℃10 s，56℃30 s，68℃2 min，35个循环；68℃5 min，4℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，以Marker 2000做比对，切下目的片段，按照胶回收试剂盒(SparkJade)回收目的片段。将目的片段克隆至pEasy-Blunt载体(TransGen Biotech)，转化大肠杆菌，涂含有Amp的抗性LB培养基过夜培养，挑选单克隆摇菌，菌液送铂尚生物技术有限公司测序，测序结果用DNAMAN进行比对。

1.4 生物信息学分析

使用在线软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测基因启动子，并用Phytozome获取基因序列上游2 000 bp的启动子序列，进行顺式元件分析。

使用在线软件ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的基本理化性质，包括氨基酸数、分子量、等电点、不稳定系数和平均亲水系数等。

利用SignalP 4.1 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)，输入氨基酸序列，预测是否含有信号肽结构。

利用WoLF PSORT Prediction(https://psort.hgc.jp/)输入氨基酸序列，进行亚细胞定位预测，选择预测膜定位分析数量最高的作为亚细胞定位结果。

使用CDD数据库在线网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，输入氨基酸序列，进行保守结构域预测。

从NCBI数据库中搜索并下载拟南芥、水稻、玉米、烟草、狗尾草的NCED蛋白氨基酸序列，利用MEGA 11软件中内置的邻接法(Neighbor-Joining)构建它们与SiNCED3蛋白氨基酸序列的系统进化树，其中Boot-strap重复次数默认1 000。

使用PBIL的SOMPA在线网站(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page＝npsa_sopma.html)，输入氨基酸序列，Number of conformational states设置 选 择4(Helix，Sheet，Turn，Coil)，Similarity threshold设置选择8，进行蛋白二级结构分析。三级结构利用Expasy的SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)进行预测，根据氨基酸排列规则，选择整体质量估计分数高的构建蛋白质三级结构模型。

1.5 实时荧光定量PCR

根据艾科瑞(AG)生物工程有限公司的荧光定量染液SYBR Green试剂盒进行实时荧光定量PCR，反应体系如下:2×SYBR Green ProTaqHS Premix 5.0 μL，引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA 1.0 μL，总体积10.0 μL。实时荧光定量PCR程序设置如下:预变性95℃2 min；PCR反应95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环；溶解曲线95℃5 s，60℃1 min，95℃持续；保温50℃30 s。所 有 数 据 经 扩 增 谷 子Actin基 因(LOC101779009)进行均一化处理，每个基因进行3次重复，依据2-△△Ct方法[21]对SiNCED3的相对表达量进行分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 SiNCED3基因的克隆

经PCR扩增，获得一条约2 000 bp的条带(图1)。切胶回收连接至pEasy-Blunt载体，转化大肠杆菌过夜培养后，挑取阳性单克隆进行测序，DNAMAN比对和NCBI-Blast结果显示，其CDNA全长1 836 bp，与水稻OsNCED3(XM_015776052.1)相似性高达89.63%。并将序列上传NCBI(OM674734)。

图1 SiNCED3基因PCR扩增图谱

2.2 启动子元件分析

如表2、图2所示，除含有较多基本元件Abox、TATA-box、CAAT-box外，SiNCED3基因还含有较多光响应元件，占比达到21%，另外还含有2种激素响应元件(ABRE、TGA-element)和2种胁迫响应元件(GC-motif、MBS)。这些顺式作用元件可能导致SiNCED3参与谷子对非生物胁迫的应答。

表2 启动子元件分析结果

图2 SiNCED3启动子元件分布

2.3 SiNCED3蛋白基本理化性质及结构分析

2.3.1 基本理化性质SiNCED3编码一个含有611个氨基酸的蛋白，蛋白相对分子质量为66.36kD，等电点(pI)为6.15，脂肪族系数为79.08，不稳定指数为39.90，亲水指数平均为-0.212，推测SiNCED3蛋白是一个稳定的疏水蛋白；信号肽预测结果显示其无信号肽序列，属于非分泌蛋白。亚细胞定位于叶绿体。

保守结构域预测结果(图3)显示，SiNCED3蛋白氨基酸序列的第12～611位特定匹配于NCED家族保守结构域PLN02258，内含一个NCED家族典型结构域RPE65。

图3 SiNCED3蛋白结构域

2.3.2 二、三级结构预测 预测结果(图4)表明，SiNCED3蛋白二级结构主要由无规则卷曲和延伸链构成，其平均占比分别为58.10%和21.77%；α螺旋和β转角较少，其平均占比分别为15.06%和5.07%。三级结构预测结果(图5)显示，预测模板为3npe.1.A(9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白)，SiNCED3蛋白与3npe.1.A匹配度高达93.33%，两个蛋白的三级结构图极其相似，GMQE值为0.9，表明模型整体质量较好，预测结果可用。

图4 SiNCED3蛋白二级结构

图5 SiNCED3蛋白三级结构

2.4 SiNCED3蛋白进化分析

用NCBI中公布的拟南芥、水稻、玉米、烟草、狗尾草的NCED氨基酸序列与SiNCED3的氨基酸序列构建蛋白进化树，结果(图6)显示，可分为两个分支，SiNCED3与同属于单子叶C4作物的玉米NCED4亲缘关系最近。

图6 SiNCED3蛋白系统进化树

2.5 SiNCED3基因表达模式分析

2.5.1 在谷子不同组织中的表达 结果(图7)表明，SiNCED3在根、茎、叶、叶鞘、穗中均有表达。在根中的表达量最高，相对表达量显著高于在其它组织中；在茎中的表达量次之，显著高于在穗和叶中的表达量；在叶中的表达量最低。

图7 SiNCED3在不同组织中的表达量

2.5.2 在不同逆境胁迫下的表达 结果(图8)表明，3种胁迫处理均可不同程度诱导SiNCED3的表达。20% PEG-6000处理6 hSiNCED3表达量最高(8.87)，约为对照的8倍。盐胁迫处理下，SiNCED3在处理0～12 h表达量较高，处理6 h达到最高(3.57)，24～48 h表达量极低。4℃低温胁迫处理下，SiNCED3基因表达量呈现先升高后下降再升高的趋势，最高值出现在处理3 h，相对表达量为8.00，处理48 h出现第2个峰值，相对表达量为7.44。

图8 SiNCED3在不同逆境胁迫下的表达量

3 讨论与结论

ABA在植物的生长发育和胁迫耐受性过程中发挥着重要作用。本研究从济谷22中克隆获得ABA合成的关键限速酶基因SiNCED3，该基因编码611个氨基酸，其蛋白无信号肽序列，属于非分泌蛋白，亚细胞定位于叶绿体中，与玉米的ZmNCED4亲缘关系最近，二级结构主要由无规则卷曲和延伸链构成；该基因启动子序列中除含有基本元件(A-box、TATA-box、CAAT-box)外，还含有光响应元件(sp1、G-box、GT1-motif、LAMPelement)、激素响应元件(ABRE、TGA-element)和逆境胁迫响应元件(GC-motif、MBS)，可能导致SiNCED3参与谷子对非生物胁迫的应答。

早期人们认为，植物叶片是ABA合成的主要部位[22]。后来证实，离体的根系，特别是根尖(根毛区至根冠)，在缓慢脱水时能合成大量ABA；非离体根在胁迫下也能够合成ABA。其它器官如花、果实和种子也能合成ABA。本试验结果也表明，SiNCED3在谷子根、茎、叶、叶鞘、穗中均有表达，且在根中的表达量最高，在叶中的表达量最低。

ABA在植物营养生长过程中的一个重要功能是调节植株对干旱、盐分、寒冷等逆境胁迫的反应。王赞等[23]研究表明低温胁迫能够诱导茶树中CsNCED2基因显著上调表达；Huang等[24]研究表明高盐和干旱胁迫都显著诱导了水稻地上部和根部的OsNCED5表达。本研究结果也证实干旱、高盐以及低温胁迫诱导了谷子体内SiNCED3基因的表达，其中，干旱胁迫3～6 h的表达量较高，盐胁迫3～12 h的表达量较高，而4℃低温处理3 h和24～48 h的相对表达量较高。初步表明SiNCED3能够参与谷子对逆境胁迫的响应，可为进一步研究该基因的功能奠定基础。