高内涵无荧光标记活细胞成像技术的建立及应用

杨 晨，刘双双，洪晓黎，毕 超，邱淑兵

（1.浙江大学医学院附属口腔医院·浙江大学口腔医学院·浙江省口腔疾病临床医学研究中心·浙江省口腔生物医学研究重点实验室·浙江大学癌症研究院，浙江 杭州 310000；2.浙江大学医学院公共技术平台，浙江 杭州 310058）

目前高内涵筛选技术作为一种成熟的自动显微成像技术，将高通量自动成像和分析结合起来，来获得单细胞水平的多参数定量化数据，涉及肿瘤治疗[1]、药物筛选[2]、毒理学[3]、细胞表型研究[4]、细胞信号通路研究[5]、活细胞生物学功能研究[6]等。随着单细胞水平研究的不断深入，高内涵成像以其自身具备的高通量自动成像、数据信息量大、智能化的定量化分析等优势，越来越受到各位研究人员的认可。DPC 可对无荧光染色的活细胞样品成像，在保证细胞结构和功能的完整性同时，通过单次试验就可以获得大量的细胞学数据。本文将就高内涵成像的DPC 模块展开介绍与成像方法详细分享，主要包括实验前样本的准备、成像参数的设置与成像过程中的注意事项以及实验数据的定量化分析等方面，旨在为从事细胞增殖和迁移等研究的学者们提供一种高效的实验方法与技术手段。

1 DPC 成像前的准备

1.1 细胞准备要求

细胞不需要进行任何的荧光染色，单层的贴壁细胞且状态好，细胞汇合率在60%～80%左右比较合适。悬浮细胞样品，可将微孔板进行包被，或采用低速离心的办法制备样品。本文分享的案例[7]是人结肠癌细胞HCT116 和LoVo，分为control 和miR-30b-5p 两组，按照2×104个细胞/孔的密度接种到96 孔板，汇合度在80%，满足高内涵DPC 成像的条件。

1.2 微孔板选择

实验选择的是PS（聚苯乙烯）材质的96 微孔板（Corning 3599），可以满足DPC 成像的需要。另外，也可以选择Perkin Elmer 开发的专用96 微孔板（CellCarrier Ultra microplates）或者Special Optics 96孔板（货号Corning 3603，美国）等。该板的底部比PS孔板的底部薄，透明的底部能降低背景荧光，成像效果会更好。

1.3 成像模式的选择

成像模式选择的是宽场模式，长时间高强度曝光会对细胞造成光毒性，所以活细胞成像也更适合使用宽场成像模式，而且应该选择尽量低的激发能量和较短的曝光时间。

1.4 物镜选择

普通多孔板适合于20 X 物镜及以下镜头，不需要观察共聚焦亚细胞结构或纹理分布，一般选择10 X 物镜拍摄，视野大，拍摄时间相对短。

1.5 仪器要求

高内涵细胞成像与分析系统需要配备温度和CO2控制模块（Temperature and CO2，TCO），能够提供活细胞长时间培养所需的温度和二氧化碳，本文使用仪器型号为Operetta（Perkin Elmer，美国）。细胞对环境要求高，需要至少提前半小时开启TCO。

1.6 数据分析

使用仪器自带的Harmony 4.1 软件，可以自行创建分析算法，也可以使用仪器的自学习功能，训练软件自动识别特定细胞，对细胞进行分组，并进行运动轨迹、位移、方向、速度等多种参数分析，实现分析结果的可视化。

2 DPC 成像技术的建立

利用Operetta 的TCO 模块提供细胞长时间培养所需的温度和二氧化碳，将96 孔板放置在活细胞工作站，在10 X 物镜下使用DPC 成像功能进行拍摄观察细胞的迁移情况。分享案例中成像使用的是Time series 即时间序列，拍摄条件设置如下：Emission：50%，Time：12 ms，Height：-2 μm，Mode：High contrast，Interval：25 min，38 个时间点，总共拍摄时长近16 h。

3 实验结果与数据分析

3.1 成像结果

图1 是利用DPC 成像技术得到的人结肠癌细胞HCT116 和LoVo，control 和miR-30b-5p 两组共四组细胞的成像数据（图片为任意选取，仅作结果展示），可以获取到所有选定孔内选定视野内每个细胞在T0-T37 共38 个时间点，近16 h 拍摄时长的实验数据，获得的成像图像信噪比高，有利于下一步正确识别细胞进行图像分割。

图1 四组细胞DPC 成像示例图

3.2 整个实验的流程图建立

对整个实验前期准备、实验开展以及数据分析做了流程的梳理，见图2。在样品准备阶段，细胞状态良好且贴壁，汇合度在80%左右。在样品成像阶段，一般在10 X 物镜下，选取宽场模式，设置好低曝光成像条件，拍摄时间序列，获得高质量的图像数据。在数据分析阶段，可以正确识别细胞，做好图像分割，最终实现实验数据的可视化。

图2 高内涵活细胞追踪成像和分析的流程图

3.3 分析算法的建立

拍摄结束后，利用高内涵强大的Image Analysis即数据分析功能，追踪到每个细胞，并建立数据分析的流程图，见图3。

图3 Image Analysis 的流程图

可以清晰地看出，依次经过Find cells、Track objects、Calculate Intesity Properites、Calculate Morphology Properites、Calculate Kinetic Properites 和 Calculate Track Properites 共六步的分析，可以获得细胞的各类参数，包括移动速度（Current Speed）、移动步径（Current Step）、在X 轴 上 的 移 动 距 离（Current Displacement X（μm））、在Y 轴上的移动距离（Current Displacement Y（μm））等。

3.4 批量数据的结果分析

分析算法建好之后，进一步利用Evaluation 模块，对整板数据进行批量运算，得到所有拍摄孔的数据。其中，如图4 分享的案例数据，其中横轴为Current Displacement X（μm），纵轴为Current Displacement Y（μm），表明细胞分别在X 和Y 轴上的移动距离。也可以根据实验分组和处理不同，进一步绘制柱状图，进行组间差异的比较，更为直观。

图4 四组细胞的移动距离示例图[7]

4 结论

本文分享的案例研究[7]采用96 孔板接种细胞，不需要做任何的荧光标记，以无标记贴壁活细胞为成像对象，统计视野内每个活细胞的迁移情况。研究中采用的数据分析方法，用时可以控制在2 h 以内，与传统的MTT 和CCK-8 方法相比较，实验时间明显减少、实验效率显著提高、通量高、可追踪、数据代表性好，分析得到的定量化数据更有说服力。MTT 和CCK-8的检测方法一般通过酶标仪测定样本的吸光度，没办法直接观察到细胞的生长情况，也不能做到定量化分析[8，9]。

图像分割是数据分析的重要步骤，如果分析软件不能很好地分割识别出每一个细胞或者要分析的个体，得到的分析结果也是不够准确的[10]。这就对成像的样品提出了一定的要求，细胞需要为单层的贴壁细胞且状态好，细胞汇合率在80%左右比较合适。细胞生长过快或者过密，可适当降低接种密度，可在50%～80%范围之间摸索。如果遇到确实特殊的细胞样品，细胞本身就很容易结团，能做的只有尽量优化成像条件，找到适合视野内所有细胞分割的条件。所以，样品制备的质量，关系着数据分析的结果好坏，至关重要。

选择合适的微孔板是高内涵实验成功的重要因素。常规微孔板底材质为玻璃、聚丙乙烯（PE）、烯烃（CO），对于绝大部分实验来说，建议使用TC-Treated PS 或CO板，TC-Treated PS 板以及CO 板都能够粘附蛋白，从而促进细胞的贴壁。玻璃底板的透光度更好，但是不适合细胞培养，如果需要使用一般可以通过包被不同的生物分子来提高细胞的贴壁以及改善细胞的生长特性。微孔板的厚度是影响透光性以及成像质量的重要因素。板底厚度在250 μm 以上的，需要长工作距离镜头，并且需要调整矫正环，不推荐板底厚度大于1 mm 的微孔板。如需要观察共聚焦亚细胞结构或纹理分布，必须用推荐薄底板。

DPC 成像，对细胞无干预，能最大限度保证细胞状态，利用近红外波长检测，最大限度地降低了光毒性和光损伤，所以特别适合长时间动态观察。DPC 成像具有通量高、样本制备方便、数据分析简便等明显优势，相信能够为开展活细胞相关研究的科研工作者们提供技术借鉴。