葛根芩连汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群及炎性因子的影响

郑晨曦，郭兴华，吴天鸽，徐少宇，冯嘉轩，孙 聪

(1.长春中医药大学 药学院，吉林 长春 130117；2.吉林大学 第二临床医院，吉林 长春 130041；3.敦化市畜牧站，吉林 敦化 133799；4.长春中医药大学 临床医学院，吉林 长春 130117)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种与肠道微生物生态失调、黏膜免疫系统受损及环境因素有关的炎症性疾病，与克罗恩病(CD)统称为炎症性肠病(IBD)，发病机制暂不明确[1]。UC发病年龄趋于年轻化，患病率及死亡率在全球范围内逐渐上升[2]。目前，UC的治疗药物主要有5-氨基水杨酸、免疫抑制剂和糖皮质激素，但长期服用存在药物毒性、感染等副作用[3]。因此探讨UC可能的治疗机制成为亟待解决的科学问题。

UC发病过程中肠道菌群紊乱可导致大量细菌死亡溶解释放脂多糖(LPS)入侵机体，LPS可能作为炎症的起始环节影响UC的发生，常用于UC模型的制备和早期诊断指标[4]。肠道免疫异常导致的黏膜免疫屏障功能受损是UC发病的重要因素，肠道免疫屏障中起核心作用的是分泌型免疫球蛋白A(sIgA)[5]。sIgA是肠道分泌最多的免疫调节蛋白，通过调节免疫反应有效保护肠道屏障的完整性，是维持肠黏膜稳态的第一道防线[6]。外周血单核细胞(MONO)是血液中体积最大的白细胞，可分化为巨噬细胞和树突状细胞，临床上常作为炎症检查的辅助诊断方法。UC患者MONO的数量与UC疾病活动度密切相关，单核细胞计数可以作为潜在的UC生物标志物[7]。

UC临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等，属于中医“泄泻”，“痢疾”，“肠澼”等范畴，葛根芩连汤(GQD)是治疗湿热所致腹泻和痢疾的经典方剂，被认为是治疗UC的经典良方[8]。GQD能调节肠道菌群及其代谢途径保护肠道[9]。但是其调节肠道菌群与炎性因子间相关性的机制仍不明确。因此，本研究旨在将肠道菌群和炎性因子相关联，探究GQD治疗UC小鼠的可能机制，为UC的防制及相关微生态制剂研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组48只SPF级BALB/c雄性小鼠[SCXK(辽)-2020-0001]购自辽宁长生生物科技股份有限公司。动物在(22±1)℃的温度，45%～65%的相对湿度下饲养，12 h光照/黑暗循环适应性饲养5 d后，将小鼠随机分为对照组(Control)、模型组(Model，4% DSS)、阳性药美沙拉嗪组(Mes，0.60 g/kg)、葛根芩连汤低剂量组(GQD-L，6.25 g/kg)、葛根芩连汤中剂量组(GQD-M，12.50 g/kg)、葛根芩连汤高剂量组(GQD-H，25.00 g/kg)，每组8只。Control组正常给予饮食和饮水，其余各组给予4% DSS自由饮用6 d。随后，Mes组和GQD组每日灌胃相应药物治疗，Control和Model组灌胃0.9%生理盐水，每日1次，连续14 d，每天记录小鼠体质量和粪便状态及隐血情况。试验结束后处死小鼠收集结肠组织，结肠内容物及血用于后续分析。

1.2 试剂及药物制备葛根芩连汤由葛根15 g，黄芩9 g,黄连9 g，甘草6 g组成，均为中药配方颗粒，购自广东一方制药有限公司(0095453，0123763，0112593，0101713)。将所有配方颗粒混匀后加入蒸馏水分别配置成6.25，12.50，25.00 g/kg混悬液；葡聚糖硫酸钠(DSS，M.W.=36 000～50 000)购自MP Biomedicals(NO.S4140)。精密称定4 g DSS溶于100 mL蒸馏水中，配制成4% DSS溶液，每日现用现配。美沙拉嗪肠溶片购自葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司(200403)，配制成0.60 g/kg水溶液；sIgA及LPS所需ELISA试剂盒购自FEIMOBIO公司(E20210701A)；粪便隐血试剂盒购自雷根生物(0615A21)；QIAamp®DNA Stool Mini Kit购自德国Qiagen，Hilden；MiSeq Reagent Kit v3试剂盒购自美国Illumina公司(MS-102-3003)；Agencourt AMPure XP PCR Purification Beads购自美国Beckman Coulter公司(A-A63880)；TopTap DNA聚合酶试剂盒购自Transgen(AP151-03)。

1.3 指标检测

1.3.1疾病活动指数(DAI) 通过小鼠体质量变化、粪便特征和粪便隐血试验计算DAI分数[10]。

1.3.2苏木精伊红(HE)染色和组织学分析 末次给药后，小鼠禁食不禁水12 h，颈椎脱臼法处死小鼠，结肠组织用4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度洗脱，二甲苯浸泡，石蜡包埋后4 μm厚切片，苏木精伊红染色，镜下观察结肠损伤程度和炎性细胞浸润情况，进行组织学分析[11]。

1.3.3肠道菌群16S rRNA测序 收集结肠中粪便样品进行粪便基因组DNA提取，琼脂糖凝胶电泳检测DAN完整性。以341F:CCTACGGGNGGCWGCAG为上游引物，以805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC为下游引物进行细菌16S rDNA的V3～V4区域PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳和QuantiFluorTM-ST荧光定量系统用于纯化和定量检测PCR扩增产物[12]。纯化的PCR产物进行DNA文库构建，通过Genesky Biotechnologies Inc.(中国上海)在Illumina MiSeq平台进行样本2×250 bp双端测序和生物信息学分析。使用QIIME2、flash2和R等软件对Reads进行数据质控和统计，运用Usearch10进行Amplicon Sequence Variants(ASV)非聚类去噪，对质控拼接好的序列按照97%相似性进行OTU聚类分析，生成操作分类单元(OTU/ASV)[13]。基于OTU/ASV聚类分析结果，利用R对α、β多样性及群落物种组成差异性进行分析。

1.3.4炎性细胞因子检测 小鼠眼球取血置于EDTA抗凝管内，全自动血液分析仪检测MONO比例。按照ELISA试剂盒说明书，将收集的血液3 000 r/min 离心10 min分离血清，洗板后各孔分别加标准品和各组待测样品50 μL，辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，封口膜封住37℃温育60 min，洗板后各孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min，每孔加入终止液50 μL，测定D450值。

1.4 数据统计分析SPSS20.0统计软件单因素方差分析(ANOVA)检验各组数据，LSD法进行多重比较。使用QIIME2、R ggplot2(v3.3.0)进行肠道菌群多样性指数分析和多样本物种组成柱状图分析。P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量及疾病活动指数(DAI)变化Control组小鼠饮水量、摄食量及毛色正常，大便成形，体质量逐渐上升，各造模组小鼠饮水及摄食量减少，背毛粗糙且无光泽，体质量下降，试验3 d出现便稀或便血现象。7 d，Model及Mes组各死亡1只小鼠，其余小鼠正常存活。治疗结束后，与Control组比较，Model组小鼠体质量显著下降(P<0.001)，DAI评分显著上升(P<0.001)。与Model组比较，Mes组体质量上升(P<0.05)，GQD-L组体质量升高(P<0.01)，GQD-M、GQD-H组体质量显著升高(P<0.001)，DAI评分均显著下降(P<0.001)(图1A，B)。

图1 不同给药对UC小鼠体质量(A)及DAI评分(B)的影响

2.2 组织病理学观察及评分结果如HE染色结果所示，Control组结肠组织黏膜上皮层完整，腺体结构清晰，隐窝完整，没有溃疡点；Model组结肠可见广泛的黏膜损伤和溃疡，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，腺体及隐窝缺失；Mes组结肠组织部分腺体恢复；GQD各组结肠组织溃疡情况较Model组明显改善，仅有少量炎性细胞浸润(图2A)。对结肠病理损伤进行评分，Model组的组织学评分显着高于Control组(P<0.001)，与Model组比较，Mes及GQD各组可显著抑制结肠组织损伤(P<0.001)，其中GQD-H组效果最显著(图2B)。

A.小鼠结肠组织HE染色(×200)；B.组织病理学评分;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。下同

2.3 葛根芩连汤对UC小鼠肠道菌群的影响

2.3.1多样性分析 以抽取的序列数及其对应的多样性指数构建Shannon-Wiener曲线，随着测序数据量的增加曲线趋于平坦，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息(图3A)。采用OTU Venn图分析菌群OTU数量及其种类交叉情况，Control和Model组的总 OTU分别为616，612个，特异性 OTU 分别为84，80个，共有 OTU为532个，占总OTU数的76.44%。与Control组比较，Model组肠道菌群物种丰度降低(图3B)。

A.样品Shannon-Wiener曲线；B.Venn图

2.3.2门水平物种组成差异 门水平上各组小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)，(各组占比60.231 9%，44.866 4%，54.479 1%，50.342 4%，52.925 3%，52.560 0%)，拟杆菌门(Bacteroidetes)(各组占比24.996 0%，36.009 7%，24.103 2%，39.295 0%，28.724 7%，33.303 1%)，变形菌门(Proteobacteria)(各组占比7.132 1%，10.259 4%，9.236 7%，4.988 0%，6.675 3%，5.335 6%)和放线菌门(Actinobacteria)(各组占比3.681 6%，2.206 0%，4.146 6%，1.469 8%，2.262 7%，1.607 4%)组成。与Control组比较，Model组小鼠的Firmicutes(P<0.001)和Actinobacteria(P<0.05)比例降低，Bacteroidetes(P<0.01)和Proteobacteria(P>0.05)比例升高，治疗后部分菌群回调。Firmicutes与Bacteroidete比值(F/B)被证明与UC病程相关[14]。本研究中Model组F/B降低，符合UC肠道菌群失调的病理特征，经Mes及不同浓度GQD干预后，F/B均上升(图4A～D)。

A～D.不同给药对UC小鼠Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria和Actinobacteria的影响

2.3.3属水平物种组成差异 为进一步比较组间差异菌群，本试验基于属水平以P<0.05作为差异显著性筛选阈值，分析各组中具有显著差异的物种，结果发现乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣球菌科未定属(Erysipelotrichaceae_incertae_sedis)、埃希菌/志贺菌属(Escherichia/Shigella)和肠球菌属(Enterococcus)是组间差异较大菌属。与Control组比较，Model组Lactobacillus比例降低15.678 1%(P<0.001)，其余3种菌属比例分别上升0.110 8%(P<0.001)，0.090 0%(P<0.001)和0.023 9%(P<0.001)。与Model组比较，Mes组Lactobacillus比例升高5.754 4%(P>0.05)，其余3种菌属比例分别下降0.117 9%(P<0.001)，0.090 2%(P<0.001)和0.023 5%(P<0.001)。GQD-L组与Model组比较，Lactobacillus比例上升9.97%(P<0.05)，Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、Escherichia/Shigella和Enterococcus比例分别下降0.088 1%(P<0.01)，0.090 7%(P<0.001)和0.030 6%(P<0.001)。GQD-M组与Model组比较，Lactobacillus比例上升2.920 0%(P>0.05)，另3种菌属比例分别下降0.118 1%(P<0.001)，0.062 7%(P<0.01)和0.026 2%(P<0.001)。GQD-H组与Model组比较，Lactobacillus比例上升8.087 8%(P>0.05)，另3种菌属比例分别下降0.115 2%(P<0.001)，0.091 3%(P<0.001)和0.030 6%(P<0.001)。4种菌属在Mes组和不同GQD组间均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 属水平小鼠肠道差异菌群丰度 %

2.4 葛根芩连汤对UC小鼠炎症因子的调节作用与Control组比较，Model组小鼠MONO比例(P<0.01)及LPS水平(P<0.001)升高，sIgA水平(P<0.001)水平降低。与Model组比较，经Mes干预后，MONO比例下降(P<0.05)，sIgA水平上升(P<0.001)。GQD-L组对3种炎性因子水平无显著性影响(P>0.05)。GQD-M组降低MONO比例(P<0.05)和LPS水平(P<0.05)，升高sIgA水平(P<0.01)。GQD-H组降低MONO比例(P<0.05)和LPS水平(P<0.01)，升高sIgA水平(P<0.01)(图5A～C)。

A.MONO比例变化;B.LPS水平变化;C.sIgA水平变化

3 讨论

在UC的治疗中，以GQD为主的中药复方在治疗方法总有效率、不良反应发生率方面优于西药[15]。GQD能够通过改善肠道炎症反应和修复肠道黏膜屏障显著治疗UC[16-17]。在这项研究中，发现UC小鼠毛发稀疏无光泽，体质量减轻，DAI评分升高，大便松散不成形，腹泻甚至便血。HE染色观察到小鼠结肠组织溃疡点，局部隐窝消失，腺体不完整及大量炎性细胞浸润。GQD可明显改善DSS所诱导的UC的病理症状，表现DAI评分和组织病理学评分降低，结肠组织溃疡点及炎性细胞浸润减少等。

UC患者的肠道菌群失调是肠道黏膜损伤的主要因素，也是衡量病程的参数之一[18]。本研究发现UC小鼠的肠道菌群多样性及F/B比值降低，与先前报道一致[19]。GQD提高了F/B比值，调节了菌群失衡状态。在门水平，各组小鼠肠道菌群主要由Firmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria和Proteobacteria组成。在属水平，GQD主要通过调节Lactobacillus、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、Escherichia/Shigella和Enterococcus水平发挥作用。Lactobacillus是肠道中的优势有益菌群，能拮抗致病菌，保持机体健康状态[20]。Erysipelotrichaceae与肠道炎症密切相关，研究表明小鼠中-重度回肠炎及结肠炎急性炎症期时肠道菌群多样性降低，Erysipelotrichaceae丰度增加[21]。用促炎因子TNF诱导引发CD样小鼠结肠透壁性炎症时，Erysipelotrichaceae的丰度也显著增加，表明Erysipelotrichaceae和 TNF水平有相关性[22]。另有研究探讨了包括 UC、CD、伪膜性结肠炎和结肠癌的3 048个公共数据库的人类肠道炎症疾病菌群表达谱，发现肠道发生炎症疾病时Erysipelotrichaceae家族丰度增高[23]。这些研究都表明Erysipelotrichaceae与UC密切相关，并且能促进肠道炎症发展。运用四氯化碳预处理豚鼠后灌入Escherichia/Shigella，豚鼠们表现出了致命的肠道感染。同样有研究检测UC患者肠道菌群，发现其肠道微生态失调主要表现为Escherichia/Shigella丰度增加，与本研究结果一致[24]。Enterococcus是肠道表层的代表菌群，在特定条件下能直接侵袭机体，导致机体发病[25]。Enterococcus在小鼠模型中促进结肠炎的发生，与健康人相比，UC患者的Enterococcus数量增加[26]。本试验结果与上述理论相符，提示GQD升高了有益菌丰度，降低了有害菌丰度，调节了UC小鼠的肠道菌群失衡状态。

肠道菌群失调通过引发肠道黏膜持续慢性炎症以及免疫异常促进UC的发生[27]。研究发现肠道菌群紊乱会导致LPS释放菌以及肠道LPS释放增加，使肠道摄入更多LPS入血并持续激活炎症通路，LPS可能是肠道菌群激发炎症反应的源头，因此LPS在UC的发展中极其重要[28]。sIgA可以中和LPS，防止细菌黏附于肠壁上，UC发病时sIgA的分泌受到抑制，肠道的抗菌定植能力减弱，有利于LPS和细菌入侵体内。sIgA通过促进细菌凝集，阻断病原体对黏膜的黏附，同时调节肠道微生物群结构维持肠腔内稳态，在肠道黏膜免疫中发挥主要作用[29]。研究表明，UC患者肠道免疫屏障受损是由于sIgA分泌障碍，减少的sIgA使病原体黏附增加，引起肠道稳态失衡，肠道黏膜受损后，肠道屏障通透性增加，进入肠道的细菌、LPS等抗原成分增多，引起炎症反应和组织破坏[30]。严伟等[31]通过研究不同严重程度的UC患者MONO计数，结果提示其与UC严重程度具有重要关系。本研究发现GQD可以回调UC小鼠MONO，LPS及sIgA水平。已知Mes主要通过抑制炎症反应治疗UC，本试验中GQD-M和GQD-H组与Mes对炎性因子的影响无显著差别，表明GQD同样有效抑制了UC的炎症反应，但GQD具体调节哪些信号通路发挥作用仍需进一步研究。

综上所述，GQD可有效修复UC结肠病变程度，升高肠道中有益菌丰度，降低有害菌丰度，调节菌群失衡状态，从而降低菌群紊乱造成的LPS水平升高，同时增加sIgA水平发挥抗炎作用。这将为UC临床上的新药研发提供理论依据。