液质联用法测定牛乳中阿苯达唑残留标志物残留量

朱建新

上海德诺产品检测有限公司（上海 200436）

阿苯达唑是一种咪唑衍生物类广谱驱肠虫药物，因其治疗效果好、毒性小等优势，被广泛用于治疗动物的肠道寄生虫感染病[1-2]。阿苯达唑进入动物体内后会代谢为阿苯达唑亚砜，阿苯达唑砜和阿苯达唑-2-氨基砜[3-4]。在体内代谢为亚砜类或砜类后，抑制寄生虫对葡萄糖的吸收，导致虫体糖原耗竭，或抑制延胡索酸还原酶系统，阻碍ATP的产生，使寄生虫无法存活和繁殖，是兽医临床使用最广泛的药物之一[5-7]。

近年来，阿苯达唑也应用到奶牛的规模化养殖中，虽然其毒性较低，但母畜长时间使用会对胎儿有致畸作用和胚胎毒性[8]。而且该药物可能在奶牛体内经代谢后残留在鲜奶中，会对人类的健康产生一定危害[9-10]。我国农业农村部和国际食品法典委员会都对牛奶中的限量进行规定，要求不得超过100 μg/kg[11]。残留标志物为阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜和阿苯达唑之和，现行国家标准和文献中尚没有同时测定牛奶中阿苯达唑及其残留物的方法，试验旨在建立一种可一次性完成阿苯达唑及其残留标志物检测的方法，并保证操作便捷。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH）（默克公司）、乙酸（CH3COOH）（国药集团）（色谱纯）；超纯水（H2O）（电阻率18.2 MΩ·cm）；PCX净化柱（艾杰尔公司）；阿苯达唑亚砜99.0%±0.5%、阿苯达唑砜98.6%±0.5%、阿苯达唑99.0%±1.0%（Dr.Ehrenstorfer）；阿苯达唑氨基砜＞99.8%（WITEGA）。

1.2 仪器与设备

5500+QTRAP液相色谱-串联质谱仪（AB Sciex）；VM-T1涡旋混匀器（上海泰坦科技股份有限公司）；RV10旋转蒸发仪（IKA）；Sorvall ST16R高速冷冻离心机（thermosorvall & fiberlite）；AL204电子天平（METTLER TOLEDO）；2300TH超声波清洗器（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件的确定

1.3.1.1 色谱柱的选择

色谱条件：色谱柱Water BEH C18柱（50 mm×2.

1 mm，1.7 μm）；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量2 μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI源）；检测方式为多反应监测（MRM）；离子化电压5500 V；离子源温度550 ℃；气帘气（psi）30.0；喷雾气GS1（psi）55.0；辅助加热气GS2（psi）55.0；阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜定性离子分别为190.9，208.0，159.2和133.2；定量离子分别为234.0，240.0，266.2和198.2。

流动相的考察。流动相A分别为0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸+10 mmol/L；流动相B为乙腈，加入乙酸铵阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜混合标准溶液，其他条件不变，上机测定，测得的响应值详见表1。综合4种残留物考虑，流动相A采用0.1%甲酸水溶液，其响应值最大，故选择之。

表1 阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜的响应值

1.3.1.2 前处理方法的选择

1.3.1.2.1 提取液考察

准确称取牛奶样品2.00 g，加入阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜混合标准溶液6.0 ng/mL，分别经甲酸+乙腈、乙酸+乙腈和柠檬酸+乙腈提取，过柱，吹干，0.1%甲酸水溶解，过膜，上机测定，测得阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜的浓度详见表2，综合考虑，采用乙酸+乙腈提取效果最好，故采用之。

表2 阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜质量浓度

1.3.1.2.2 净化柱考察

准确称取牛奶样品2.00 g，加入阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜混合标准溶液5.0 ng/mL，经乙酸、乙腈提取，分别过C18柱、PCX柱和HLB柱，吹干，0.1%甲酸水溶解，过膜，上机测定，测得阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜的浓度详见表3，综合考虑，过PCX柱效果最好，故采用之。

表3 阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜的质量浓度

2 结果与分析

2.1 线性与范围

在优化条件下，对质量浓度分别为2.0，5.0，10，20，50和200 ng/mL的阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜标液进行分析，以质量浓度（μg/mL）为横坐标X，以相应峰面积（Y）为纵坐标Y，建立标准曲线，得到的线性回归方程和相关系数详见表4。

表4 阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜线性方程及相关系数

2.2 准确度试验

称取牛奶样本，进行2.0，6.0和20 μg/kg这3个水平的加标回收试验（n=6），阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜回收率在82.5%～112.5%，SRSD范围为0.49%～2.02%，结果详见表5。

表5 阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜加标回收试验结果

2.3 重复性试验

为测试试验方法的重现性，选取1份有牛奶样本，每天对其进行加标测定8次（加标质量分数2 μg/kg），连续测定3 d，考察方法的日内精密度（n=8）和日间精密度（n=3）试验，结果表明，日内精密度的相对标准偏差SRSD为1.72%，日间精密度的SRSD为2.15%。

2.4 检出限试验

空白样品（牛奶）中添加50 ng/mL标准阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜溶液20 μL于2 g空白样品（即加标质量分数0.5 μg/kg），使用优化后的样品处理方法和流动相，上机测定，测得阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜的信噪比S/N均≥3，检测结果详见表6，即检出限可降低至0.5 μg/kg，定量限可至2.0 μg/kg，该方法具有较高的灵敏度。

表6 阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜信噪比

3 结论

综上所述，采用0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，用乙酸+乙腈提取，经PCX柱净化，从线性与范围、准确度、重复性、检出限等方面进行了考察，结果表明该方法简便易行，测定结果准确可靠，灵敏度高，检出限低至0.5 μg/kg，可用于牛乳中阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑-2-氨基砜残留物的测定，为牛乳中阿苯达唑残留标志物残留量的控制提供方便可行的技术手段。