紫檀芪通过调控细胞自噬对抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤

付华君，宋文英，田俊斌，李 扬

(1.陕西省人民医院麻醉科，陕西 西安 710068；2.西安交通大学第二附属医院麻醉科，陕西 西安 710004)

细胞自噬在疾病的发生和发展过程中具有重要价值。自噬参与降解凋亡细胞以及冗余蛋白质、细胞器清除，在维持细胞稳定性及线粒体能量利用方面具有积极的意义[1-2]。生理情况下细胞自噬对自身结构和功能具有保护作用，但在病理状态下则可能给机体带来严重损坏[3]。研究表明[4-5]，在心肌缺血/再灌注损伤(Myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)过程中，自噬反应极其活跃，其可分为两个阶段，在心肌缺血阶段，自噬因线粒体能量代谢受损以及氧化应激等而激活，这一过程对于心肌细胞功能和结构的维护具有积极的保护意义，但在再灌注阶段，过度激活的细胞自噬反作用于心肌细胞，造成蛋白质和细胞器清除，最终引起心肌细胞坏死。因此，探索一种调节细胞自噬于适当水平的方法或药物对MI/RI过程中维护心肌功能和结构具有重要意义。有研究报道，紫檀芪作为一种中药活性成分，可有效抑制肿瘤、治疗糖尿病并发症、保护心脑血管功能[6]，但在治疗MI/RI方面鲜有报道。因此本研究拟构建MI/RI大鼠模型，探究紫檀芪在MI/RI过程中的作用，并从自噬方面探究其作用机制，为其在保护心肌功能方面提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验 SD 大鼠，雌雄各半，72只，购于西安交通大学医学院，体重160～180 g，动物合格证号SCXK(陕)2014-002，饲养环境：温度(24±2)℃，湿度55%，照明采用光照，黑暗/照明=12 h∶12 h，所有大鼠自由进食饮水。

1.2 主要材料 紫檀芪(萨恩化学技术有限公司，货号：A01E1003520050)；阿司匹林注射液(哈药集团生物工程有限公司，批号：H20084565)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)(货号：CSB-E14403r)和乳酸脱氢酶(LDH)(武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E11324r)；氧化和抗氧化应激相关指标丙二醛(MDA，货号：A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD，货号：A001-3-2)、过氧化氢酶(CAT，货号：A007-1-1)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，货号：A005-1-2)(南京建成生物工程研究所)；自噬相关5同源物(Atg5)、卷曲肌球蛋白样Bcl-2相互作用蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅰ/Ⅱ)、p62和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(美国cell signaling technology公司，货号分别为12994S、3495S、12741S、16177S和5174S)；相对应的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：TA09)，其他试剂和耗材等为实验室库存。

1.3 主要仪器 V1300型分光光度计(上海美析仪器有限公司)；DNM-9606型酶标仪(南京普朗医疗设备有限公司)；Sorvall Legend Micro 17型低温高速离心机(赛默飞世尔科技中国有限公司)；8930086D型超低温冰箱(赛默飞世尔科技中国有限公司)； EX225ZH/AD型分析级天平(奥豪斯仪器上海有限公司)；电Mini Pro3型泳槽(美国伯乐生命医学产品公司)；Bio-Rad Mini型电泳仪(美国伯乐生命医学产品公司)；Quant Studio 6型实时荧光定量PCR仪(赛默飞世尔科技中国有限公司)。

1.4 大鼠分组、给药、模型构建及组织收集方法 将SD大鼠适应性饲养1周，按随机数字表法随机分为六组：假手术组即假手术组(10 ml/kg 0.9%氯化钠溶液灌胃)；MI/RI组即心肌缺血/再灌注损伤模型组(10 ml/kg 0.9%氯化钠溶液灌胃)；阿司匹林组(30 mg/kg阿司匹林灌胃)；紫檀芪低剂量组(10 mg/kg)、紫檀芪中剂量组(20 mg/kg)和紫檀芪高剂量组(40 mg/kg)灌胃时将其分散于0.9%氯化钠溶液中。各组连续给药14 d，1次/d。

模型构建：所有大鼠均于末次给药1 h后，构建MI/RI动物模型。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，剔除手术区域的毛发，消毒后从左侧第3～4根肋骨开胸，充分暴露心脏，寻找冠状动脉左前降支，除假手术组外，所有大鼠均对左前降支下穿线并结扎(假手术组只进行穿线但不结扎)，结扎30 min后松开结扎线，恢复血流后再灌注2 h。

标本收集：上述完成后，采集腹主动脉血，3000 r/min离心10 min，收集上清液，分装于1.5 ml的离心管中被用于相关生化指标的检测；动物处死后取出心脏，0.9%氯化钠溶液充分洗涤后进行后续相关指标检测。

1.5 大鼠心肌梗死面积的测定 根据文献报道方法[7]，将取下的心脏切除心房后，称取左心室湿重，后沿心脏长轴将其横切，放入棕色瓶中，用0.5% NBT 磷酸盐缓冲液37 ℃水浴中浸泡1 min后取出即可(评价方法为梗死区面积不着色，非梗死区呈紫红色，切下梗死区称重即可)。心肌梗死面积=(缺血梗死心肌重/左心室湿重)×100%。

1.6 大鼠心功能和血清抗氧化指标的测定 所有指标的测定均严格按照试剂盒说明书进行，其中SOD、CK-MB和LDH的测定仪器为酶标仪，GSH-Px、CAT 和 MDA的测定仪器为分光光度计，测定相应数值后，根据对应公式即可计算得到结果。

1.7 心肌组织形态学的观察 病理学观察时，横切一小块心肌组织，置入4%的多聚甲醛溶液中保存24～72 h后取出，依次梯度乙醇脱水、浸蜡、包埋切片、脱蜡、苏木素及伊红染色、中性树胶封片等，完成后采用带有照相功能的光学显微镜拍摄图像。

1.8 目标蛋白表达的检测 根据总蛋白提取试剂盒说明书提取心肌总蛋白，提取后采用BCA法对其定量并调平，采用水浴锅煮沸 5 min使蛋白变性，后每组各取50 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后转移到PVDF膜，裁剪目的蛋白后，加入5%的牛血清蛋白封闭2 h，2 h后取出加入一抗封闭过夜孵育，次日取出后加入二抗孵育30 min，洗涤3次后暗室曝光洗片，Image J计算各条带灰度值，进行比较分析。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行统计学处理。数据以均数±标准差表示，组间比较采用 Student’st检验；以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 在整个实验过程中，有部分大鼠发生死亡，其中假手术组无死亡情况出现，MI/RI组死亡2只，阿司匹林组死亡1只，紫檀芪低剂量组和中剂量组各死亡2只，紫檀芪高剂量组死亡1只。

2.2 心肌组织病理学变化 假手术组心肌纤维排列整齐，细胞核均匀分布清晰可见，MI/RI组心肌纤维出现明显的断裂，部分坏死，部分细胞结构模糊，与MI/RI组比较，各治疗组明显好转(图1)。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色结果(×400)

2.3 心肌梗死面积 假手术组未见心肌梗死，MI/RI组心肌梗死面积明显增加；与MI/RI组比较，紫檀芪干预组和阿司匹林组心肌梗死面积均明显降低，但紫檀芪各组并无剂量依赖性，差异并不明显，此外紫檀芪给药组与阿司匹林组比较差异无统计学意义(图2)。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与MI/RI组比较，#P<0.05

2.4 血清心功能指标LDH和CK-MB比较 与假手术组比较，模型组LDH 和CK-MB 明显升高(P<0.05)，给予紫檀芪和阿司匹林治疗后二者均明显降低(P<0.05)，但紫檀芪给药组与阿司匹林组比较并无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清心功能指标LDH和 CK-MB比较(U/L )

2.5 对血清氧化和抗氧化指标的影响 与假手术组比较，MI/RI组大鼠血清中 SOD、CAT 和 GSH-Px 含量明显降低，而MDA 则明显增加(P<0.05)。与 MI/RI组比较，各治疗组 MDA 含量显著降低，SOD、CAT和GSH-Px均明显升高(P<0.05)；此外，紫檀芪中剂量组和高剂量组SOD、CAT和GSH-Px明显高于阿司匹林组(P<0.05)，MDA则明显低于阿司匹林组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清氧化和抗氧化指标比较

2.6 对自噬相关蛋白表达的影响 与假手术组比较，MI/RI组大鼠心肌组织中 LC3Ⅱ、Beclin1和Atg5 蛋白表达均明显升高，p62 蛋白表达明显表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与 MI/RI 组比较，紫檀芪各剂量组LC3Ⅱ、Beclin1 和 Atg5 蛋白表达明显下降，p62 蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表3。

图3 各组大鼠心肌组织自噬相关蛋白表达图(其中A、B、C、D、E和F分别为假手术组、MI/RI组、阿司匹林组、紫檀芪低、中、高剂量组)

表3 各组大鼠心肌组织自噬相关蛋白的相对表达量

3 讨 论

紫檀芪化学名为3,5-二甲氧基-4’-羟基二苯乙烯，其因首次发现于紫檀中而命名，是白藜芦醇的二甲基衍生物[8]。当前关于白藜芦醇的研究目前已经较多，而紫檀芪的研究相对较少，现代药理学研究证实紫檀芪和白藜芦醇在药理活性上具有相似性，二者均可以有效的抑制肿瘤、治疗糖尿病并发症、保护心脑血管疾病等，其机制可能与提高抗氧化能力及减轻炎症反应有关[9-10]。紫檀芪在亲脂性和口服吸收效率上明显增加，因此具有更高的生物利用度[11]。近年来关于紫檀芪在心脏相关疾病包括MI/RI的研究也有相关文献报道[12-14]，本研究同样采用紫檀芪干预MI/RI大鼠，结果发现，紫檀芪在降低心肌梗死面积、改善心肌组织病理学以及调节心肌自噬等方面具有很好的效果，与上述学者的研究具有一致性。

自噬与MI/RI的产生关系密切，可能是MI/RI后心肌有效恢复的核心。自噬发生的过程中，Beclin1、Atg5、LC3和p62四种蛋白起关键作用，故也被认为是自噬过程的特异性标记物[15-16]。在上述四种蛋白中，Beclin1 主要作用为与Ⅲ型磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3KC3)形成稳定的复合物，这种稳定的复合物可以调控ATG 蛋白自噬体的形成。而在ATG蛋白中，又以Atg5 为核心，其主要作用为促进相关自噬体的延伸[17]。LC3Ⅱ是可以反映自噬体数量的核心指标，其含量的高低可以准确的反应自噬体数量的高低[18-19]。p62则正好相反，其主要作用为吞噬自噬体，进而抑制自噬的发生[20]。对于心肌缺血/再灌注损伤而言，当细胞发生自噬时，Beclin1、LC3Ⅱ及 Atg5表达增加，p62 表达下降，因此通过检测上述四个指标可以准确的反应细胞自噬发生的状态。本研究发现相较于假手术组，MI/RI组Beclin1、LC3Ⅱ及 Atg5表达增加，p62 表达下降，这和相关文献报道是一致的[21]，而相较于MI/RI组，各治疗组Beclin1、LC3Ⅱ及 Atg5表达明显降低，p62表格明显升高，这提示紫檀芪对MI/RI细胞自噬的发生具有明显的抑制作用。

细胞自噬是一个复杂的过程，文献报道[22]氧化应激与细胞自噬存在相互作用。MI/RI过程中心肌细胞线粒体功能障碍，细胞产生过量自由基，进而激活氧化应激。在氧化应激过程中，核酸以及脂类等大分子会被破坏、分解，产生大量自由基和MDA，因此MDA也常被用来评价心肌细胞是否受到氧化应激攻击的指标。对于氧化应激而言，体内也存在着一些防御系统，这些防御系统包括SOD、CAT 和 GSH-Px 等[23]，这些抗氧化因子的存在有利地清除了过氧化产物，保护了心脏。本研究结果显示，与假手术组比较，MI/RI组心肌组织中MDA明显升高，而SOD、CAT和 GSH-Px显著下降，这提示，在心肌缺血/再灌注损伤过程中，氧化应激增加，而紫檀芪则可以明显的降低MDA，同时升高SOD、CAT 和GSH-Px 水平。这提示，紫檀芪可提升MI/RI大鼠心肌的抗氧化能力。

综上所述，本研究提示紫檀芪能减轻大鼠MI/RI，其可能的机制是抑制自噬、减轻氧化应激和维持心肌细胞完整性。