Bacillus humi耐盐及产表活剂性能研究

胡 敏，刘美娇，曲丽娜，卞立红，殷亚杰，张奕婷，徐晶雪，任国领

(大庆师范学院 生物工程学院，黑龙江 大庆 163712)

1 引言

近几年，随着油气资源的不断开发，原油的泄漏和污染事故频频发生，而生物修复是一种行之有效的方法[1]。许多采油菌都具有产表活剂的特性，因而在石油生产中有着十分重要的作用[2]。表面活性剂有增溶、乳化、润湿、分散、使表面张力降低等特性，还具有无毒、生物降解、表面活性高等特点，在石油工业中有着广泛的应用前景[3]。由于大庆油田的油层环境非常复杂，且常常是高盐环境，所以采油微生物具有耐盐和产表活剂的性能是十分必要的[4]。生物表面活性剂能加速原油的分解，并能降低原油的表面张力，改变微生物的膜结构，加速微生物与原油的接触，增强微生物对原油的利用[5，6]。

在产表活剂的微生物中，以假单胞菌和芽孢杆菌(G+)研究的最多[7]。Bacillus humi(土地芽孢杆菌)是中等酸性土壤中的一种促进植物生长的杆菌，是一种革兰氏阳性需氧芽孢杆菌。该菌细胞薄，微弯曲，圆端，高度活跃的杆状细胞，单独出现或成对出现[8-10]。芽孢杆菌具有优良的耐盐等抗逆性，其耐盐机制是通过调节自身耐盐基因的表达来实现的[11]。本研究对油藏采出水分离并鉴定的Bacillus humi菌株的耐盐及产生物表面活性剂的性能进行了分析，为该菌的进一步利用提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

Bacillus humi菌株、原油。

2.2 主要试剂与培养基

无机盐溶液：NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.1%、MgSO40.025%、NaNO30.2%、NaH2PO40.5%、Na2HPO41.0%[4]。

LB培养基：蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，NaCl 2 g，200 mL蒸馏水。葡萄糖耐盐培养基：无机盐溶液中添加原油4%、酵母粉0.05%，固体葡萄糖耐盐培养基需添加2%琼脂。耐盐降油培养基：无机盐溶液中添加原油0.1%[4]。发酵培养基：葡萄糖5 g，酵母粉1 g、蛋白胨2 g、pH=7，蒸馏水1000 mL[11]。

所有的培养基使用前均经过120 ℃高压蒸汽灭菌处理20 min。

2.3 菌种活化

将菌株接种在200 mL的LB培养基中，置于43 ℃、120 rpm的摇床中培养24 h，将培养后的菌液于4 ℃冰箱内保存，备用。

2.4 Bacillus humi菌株耐盐特性研究

2.4.1 不同盐浓度下菌株的生长情况

菌液以2%的接种量接入含原油4%的盐浓度为0%、2%、5%、10%、15%的葡萄糖耐盐培养基中，置于摇床中43 ℃、120 r/min培养6 d，分别在2～6 d取样涂布平板计算活菌数。

2.4.2 不同盐浓度下微生物对原油的降解作用

菌液以10%的接种量接入含原油0.1%的盐浓度为0%、2%、5%、10%、15%的耐盐降油培养基中，置于摇床中43 ℃、120 rpm培养5 d。将培养后的液体样品置于分液漏斗中，加入30 mL正己烷进行萃取，振荡，静置3 min。选定256 nm的波长处，用10 mm石英比色皿，以正己烷为参比，测量其吸光度[12]。

2.5 Bacillus humi产表活剂性能研究

乳化指数(E24)与表面活性剂的浓度成正比，测定在不同温度、pH值、盐浓度条件下菌株培养液乳化指数(E24)的大小，以探究不同培养条件对菌株产生表面活性剂能力的影响。将培养后的液体10000 r/min离心20 min去除菌体，取已去除菌体的菌株培养液和液体石蜡各5 mL分别加入尖头离心管中，漩涡震荡2 min 混合均匀，室温静置 24 h 后测量其乳化层高度，并按照下式计算E24[13]：

(1)

式(1)中：he为乳化层高度(cm)；h为液体总高度(cm)。

2.5.1 菌株产生物表面活性剂的最适温度的研究

菌株以10%的接种量接种至发酵培养基中培养，分别在27 ℃、32 ℃、37 ℃、43 ℃、47 ℃，120 r/min的摇床中培养48 h，取样测定菌株培养液的E24。

2.5.2 菌株产生物表面活性剂的最适pH值的研究

发酵培养基其他成分不变，调节pH值分别为7、8、9、10、11、12、13，菌株以10%的接种量接种至不同pH的发酵培养基中，置于43 ℃、120 r/min的摇床中培养48 h，取样测定菌株培养液的E24。

2.5.3 菌株产生物表面活性剂的耐盐性能的研究

发酵培养基的其他成分不变，按 照0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%的质量分数添加 NaCl，将菌株以10%的接种量接种至不同盐度的发酵培养基中，置于43 ℃、120 r/min的摇床中培养48 h，取样测定菌株培养液的E24。

3 结果与分析

3.1 Bacillus humi耐盐性能结果与分析

3.1.1 不同盐浓度下菌株的生长情况

在2%的盐浓度下，培养2 d后，菌体浓度达到1.08×106cfu/mL，然后菌体浓度下降，在第5天和6天时，菌体浓度下降到低于盐浓度为0时的水平。这表明，尽管在葡萄糖耐盐培养基中，较高的盐浓度会显著促进Bacillus humi菌株的生长，但该效应会加快Bacillus humi菌株的代谢，从而加速进入衰亡期。当盐浓度为10%和15%时，Bacillus humi菌株的生长受到严重的抑制，至第4天后菌体开始生长，这表明Bacillus humi菌株对高盐环境具有一定的耐受性。因此， 0%～2%的盐浓度范围内Bacillus humi菌株有较好的生长，当盐浓度大于5%以后，对其生长有所抑制(表1和图1)。

图1 不同盐浓度下菌株的生长情况

表1 Bacillus humi菌株在葡萄糖耐盐培养基培养生长的菌落数 cfu/mL

大庆盐碱地的土壤含盐量高，较高的盐浓度会显著地抑制油田中的微生物生长。无机盐对细菌的生长有两方面的影响：一是在高盐分的环境条件下，细胞出现脱水现象，使其生长速率降低，最后导致细胞的死亡；二是一些金属元素对微生物来说是微量元素，当盐含量过高时，会对细胞产生一定的毒性，使其生长速度减慢，甚至使细胞死亡[14]。实验结果表明，盐浓度对Bacillus humi菌株的生长有一定的影响。

3.1.2 不同盐浓度下微生物对原油的降解作用

不同的石油降解菌对于石油中各种烃类的降解能力不尽相同，大部分细菌仅能降解一种或多种烃类，可以通过正己烷萃取后溶液中烃类的含量来分析该菌株对原油的降解程度。根据Bacillus humi菌株在不同盐浓度下的吸光度测定发现，在盐浓度为5%时测定的吸光度最高，OD值为2.23，与盐浓度为2%和10%的OD值无显著性差异，但显著高于盐浓度为0%的OD值和15%的OD值(P=0.052)。在5%的盐浓度下，原油中烃类的溶解性增加，由原来的疏水状态转变为亲水状态，导致正己烷中烃类含量增加，因此测定的吸光度值最高。由此可以推断出，在5%的盐浓度下Bacillus humi菌株对原油的降解效果最好。15%盐浓度下的菌株培养液在培养过程中，大部分原油凝聚在三角瓶壁上，原油中的烃类没有得到较好的溶解，因此最终测定的吸光值有一个较低的趋势(表2、表3、图2)。

表2 摇瓶油降解实验现象

表3 正己烷万烷萃取后上清液OD值

图2 盐浓度对OD值影响的结果

3.2 Bacillus humi产表活剂性能结果与分析

表面活性剂能增大石油烃类物质在水相中的溶解度，提高污染物在土壤中的传递速率和生物可利用性，进而促进降解。产表面活性剂的性能弱、营养组分的减少、溶解氧的降低、有毒物质的积累、菌体浓度的大幅度下降，是影响石油降解率持续增长的几个主要原因[15]。

3.2.1 菌株产生物表面活性剂的最适温度的研究

由表4和图3可知，温度对微生物的生长和产生物表面活性剂的能力有一定的影响。由实验结果可知，Bacillus humi菌株培养液的整体E24在37.5%～40.0%范围内。在43 ℃条件下菌株培养液的E24显著高于27 ℃和32 ℃条件下的E24，但与37 ℃和47 ℃条件下菌株培养液的E24无显著性差异，43 ℃时E24=40.0%最高，在这个温度下，菌体的生长和代谢速度最快，产表面活性剂浓度最高。同时也说明，Bacillus humi菌株在27～47 ℃的温度范围内都能很好的繁殖和产生物表面活性剂，产表活剂浓度最适范围为37～47 ℃。

表4 不同温度条件下培养液的乳化指数(E24)

图3 不同温度条件下的培养液乳化指数(E24)

3.2.2 菌株产生物表面活性剂的最适pH值的研究

由表5和图4可知，pH值与菌株产生物表面活性剂密切相关。不同pH值培养条件下菌株培养液的整体E24在36.4%～42.4%之间，菌株Bacillus humi在碱性较高的环境中仍可产生物表面活性剂。pH值为 7、8、9的条件下菌株培养液的E24无显著性差异，pH值为8条件下菌株培养液的E24=42.4%显著高于pH值为7、9、10、11、12、13的E24。结果表明： Bacillus humi菌株产表活剂的最佳pH值是8，pH 值为7～9时生物表面活性剂的产率均较高。

表5 不同pH条件下培养液的乳化程度

图4 不同pH值条件下的培养液乳化指数(E24)

3.2.3 菌株产生物表面活性剂的耐盐性能的研究

由表6和图5可知，不同NaCl浓度培养条件下菌株培养液的整体E24在36.7%～40.6%之间，当NaCl浓度为0%、1%、7%、8%、9%时，菌株培养液的E24无显著性差异。在NaCl浓度为3%条件下，该菌株培养液的E24=40.6%显著高于其他NaCl浓度下菌株培养液的E24。由此可见，Bacillus humi菌株产生物表面活性剂的最适NaCl浓度为3%，在NaCl浓度为2%～4%条件下产生物表面活性剂能力均较强。当NaCl的含量超过4%时，Bacillus humi菌株产生物表面活性剂的能力会受到影响，但差异仍不显著。

图5 不同NaCl浓度条件下的培养液乳化指数(E24)

表6 不同NaCl浓度条件下对培养液乳化指数(E24)的影响

4 结论

Bacillus humi菌株是从大庆油藏采出水中筛选出来的土地芽孢杆菌，在耐盐性能实验中，主要对Bacillus humi菌株的耐盐能力和在不同盐浓度下对原油的降解情况进行的研究。结果表明：盐浓度对该菌株的生长和原油降解均有较明显的影响，在0%～2%的盐浓度下最适生长，在5%的盐浓度下对原油的降解效果最好。Bacillus humi菌株表现出较好的耐盐性及高效原油降解效率，具有修复原油污染盐渍化土壤的应用潜力。

在Bacillus humi产表活剂性能实验中，测定在不同培养温度、pH值、盐浓度条件下Bacillus humi菌株培养液乳化指数(E24)的大小，以探究不同培养条件对菌株产生表面活性剂能力的影响。结果表明：Bacillus humi菌株生长的最佳温度为43 ℃，在此温度下产生物表面活性剂的能力最强，最适生长范围为37～47 ℃；产生物表面活性剂的最适pH值为8，在pH值7～9条件下产生物表面活性剂能力均较强；产生物表面活性剂的最适NaCl浓度为3%，在NaCl浓度为2%～4%条件下产生物表面活性剂能力均较强，在最适条件下Bacillus humi菌株产生物表面活性剂的E24均达到40%，具有很强的产生物表面活性剂的特性，在实际应用中具有强大的竞争力和明显的优越性。