赛氏杆菌抵抗性及常见物理灭菌方法对其灭活作用

赫英姿 宋 策 于庭洪 贾 姝 赵 翀 左玲玲

(辽宁省蚕业科学研究所 辽宁 凤城 118100)

柞蚕核型多角体病毒是柞蚕脓病的病原微生物，在烈日曝晒(44.3～48.7 ℃)3 d以上能失活，经100 ℃沸水煮5 min，可以完全失活[1]。柞蚕微粒子孢子是柞蚕微粒子病的致病菌，在干热100 ℃条件下30 min,或湿热100 ℃条件下10 min，0.1 MPa高压条件下30 min，均可失活[2]。柞蚕链球菌是柞蚕空胴病的致病菌，柞蚕链球菌100 ℃蒸汽处理5 min失活，干热处理60 min失活，高压(0.05～ 0.1 MPa)蒸汽处理5 min失活[3]。塞氏杆菌是柞蚕败血病致病菌，是一种短杆菌，活菌大小约为(0.98～1.34)μm×(2.94～4.22)μm，有周生鞭毛，能运动，革兰氏阴性，不形成芽孢。塞氏杆菌又名灵菌，能产生红色的“灵菌素”，菌落玫瑰红色，半透明。关于赛氏杆菌的抵抗性尚未见报道，为此，本文进行了赛氏杆菌的自然抵抗性和几种物理灭菌方法的试验研究。

1 材料与方法

1.1 菌液的制备

将本实验室保存的柞蚕败血病致病菌塞氏杆菌菌株活化，用LB固体斜面培养基37 ℃条件下培养24 h做为供试菌，每支试管加2 mL无菌水洗脱。将菌液倒入1.8cm×18cm试管中，用振荡器振荡均匀。用血球计数板计算菌液浓度为7.0×106 mL-1。取50 μL菌液于载玻片上，用无菌玻璃棒涂抹均匀，阴干备用。

1.2 自然抵抗性测试

1.2.1 室内光线的影响

取上述载玻片上14片，7片置于实验台上见光，另外7片置于试验柜内避光，分别于不同时间后接种于平面培养基上，37 ℃条件下培养，观察、判断病菌是否失活。

1.2.2 野外光线的影响

在柞树叶片表面和背面分别涂抹菌液，树上温度计显示32 ℃，分别于0.5 h、1 h、2 h、3 h后接种。37 ℃条件下培养，观察、判断病菌是否失活。

1.2.3 阳光照射的影响

将涂菌载玻片置于地面阳光下，地表温度42～34 ℃。分别于0.5 h、1 h、2 h、3 h后接种于平面培养基上，37 ℃条件下培养，观察、判断病菌是否失活。

1.3 灭菌方法试验

1.3.1 紫外线照射

涂菌载玻片阴干后置于30 W紫外灯下40cm处照射，照射时的温度为24 ℃。分别于照射1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h后将菌液接种到平板培养基上，37 ℃条件下培养，依据文献[3]中的有关标准，观察、判断病菌是否失活。

1.3.2 高温干热处理

涂菌载玻片阴干后置于干燥箱中，100 ℃条件下分别于处理10 min、20 min、1 h后，接种于平面培养基上，培养条件同上。

1.3.3 高压蒸汽处理

涂菌载玻片阴干后置于高压蒸汽灭菌锅中，不与水接触，相同压力下分别于处理3 min、5 min、10 min后，接种于平面培养基上，培养条件同上。

1.3.4 高温蒸汽处理

涂菌载玻片阴干后置于蒸锅中，锅中水始终保持沸腾状态，但不与载玻片接触。分别于处理3 min、5 min、10 min后，接种于平面培养基上，培养条件同上。

1.3.5 恒温水浴处理

将2 mL菌悬液加人试管后置于水浴锅中，在60 ℃、65℃、70 ℃条件下处理5 min、20 min、1 h后，用接种环将处理后的菌悬液接种于平面培养基上，培养条件同上。

2 结果与分析

2.1 室内光线影响情况

由表1结果可以看出，塞氏杆菌自然存活时间较短，且对光线敏感。涂菌载玻片见光处4 d失活，避光处7 d失活。

表1 涂菌载玻片明亮、避光放置失活情况

2.2 室外叶片失活情况

由表2结果可以看出，赛氏杆菌在室外柞叶表面较快失活。叶表3 h，叶背4 h，接种培养没有菌落长出。叶表温度为32 ℃。

表2 涂菌叶表、叶背失活情况

2.3 日光直射的影响效果

由表3结果看出，赛氏杆菌对光线敏感，日光直射下1 h就失活。地表温度40 ℃。

表3 日光下照射不同时间失活情况

2.4 紫外线照射的灭菌效果

赛氏杆菌对紫外线敏感，30 W紫外灯于0.4 m距离处照射3 h使其失活。

表4 紫外线照射不同时间失活情况

2.5 高温干热处理、高压蒸汽处理、常压蒸汽处理、高温水浴处理的失活情况

赛氏杆菌对高温、高压、蒸汽的耐受能力较弱，经过8 d的接种培养表明：高温干热100 ℃处理10 min失活；高压( 0.05～ 0.1 MPa) 蒸汽处理3 min即可失活；常压蒸汽处理5 min即可失活；高温( 70 ℃)水浴处理5 min即可失活，而在60 ℃水浴中处理5 min尚不失活。

3 讨 论

塞氏杆菌是导致柞蚕发生败血病的致病菌之一，试验结果表明其自然抵抗性较弱，通过普通的物理方法就可以将其杀死，因而该菌的利用，则需要在使用前配置菌液，以免菌体失活。养蚕实践中为避免该菌的为害，养蚕用具及环境只要提前一周洗刷晾干备用即可，养蚕室配合紫外灯使用。

塞氏杆菌在普通细菌培养基上所形成的菌落为玫瑰红色，即灵菌红素。灵菌红素是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，是一些放线菌、沙雷菌及其他细菌的次级代谢产物，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物活性。灵菌红素有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性，目前主要由一些微生物产生，也可以通过全合成制得，对于微生物资源及发酵生产的优化一直在研究之中[4-5]。在灵菌红素的生产中目前还没有人利用柞蚕蛹筛选高产菌株以及相应的灵菌红素生物活性物质。笔者在试验中得知：灵菌在柞蚕幼虫和成虫之间通过体壁创伤的方式很容易传染，而且感染率很高[6]，柞蚕幼虫及蛹尸体内的灵菌在4 ℃冰箱经过6个月仍然具有活性，由此认为柞蚕作为生产灵菌红素的昆虫资源是可以利用的。因此，研究塞氏杆菌的自然抵抗性和物理灭菌方法，对开展该菌的利用研究很有必要。