舒肝和络醒脾方对肝纤维化模型大鼠肝组织Wnt/β-Catenin信号通路的影响

王奎淞， 张秋菊， 魏书瑶， 殷世鹏， 李婕妠， 陈世玉， 郭嘉琪， 赵鲲鹏

甘肃中医药大学 a.中医临床学院， b.基础医学院， c.公共卫生学院， d.图书馆古籍部， 兰州 730000

肝纤维化是各种慢性肝损伤导致的肝内胶原纤维异常增生的病理过程，是多种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段。由于其形成机制十分复杂，目前在临床上尚无理想的、公认的抗纤维化特效药物[1]。中药复方汤剂具有经多靶点、多途径发挥作用的特点，在抗肝纤维化治疗中具有独特优势。甘肃省国医大师周信有教授将肝纤维化“细胞外基质沉积(肝损伤)-肝纤维化特征性改变(纤维化)-大量假小叶形成(肝硬化)”过程提炼为中医学“络脉瘀滞-微小癥积-癥积形成”理论，提出“舒肝和络醒脾法”学说，并基于此结合临床验效拟舒肝和络醒脾方，具有舒肝醒脾、祛瘀活络、益气养血之功效[2]。

Wnt/β-Catenin是具有调节细胞增殖和分化功能的Wnt家族经典蛋白信号通路，当该信号通路被激活后，可以调节许多器官的纤维化发展过程，与肝纤维化疾病的发生发展密切相关[3]。且该通路Wnt1/β-Catenin/Cyclin D1导致肝纤维化形成的机理与“舒肝和络醒脾法”学说不谋而合。故本研究旨在观察舒肝和络醒脾方对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠的治疗作用，并探讨其是否通过调控Wnt/β-Catenin信号通路发挥影响，验证“舒肝和络醒脾法”学说的科学性，并为该复方的临床应用提供实验数据支撑和理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性6周龄SPF级Wistar大鼠60只，体质量(200±20)g，饲养于室温20～25 ℃，湿度50%～65%的12 h光暗循环环境，自由进食和饮水，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号：SCXK(甘)2020-0001，实验动物使用许可证编号：SYXK(甘)2020-0009。

1.1.2 药物及制备 舒肝和络醒脾方组成：醋柴胡10 g、岷当归15 g、炙黄芪12 g、莪术12 g、鳖甲10 g、枳椇子10 g，购于甘肃中医药大学附属医院。灌胃药剂采用水提法将各单味药物按临床用药比例混合制备：(1)加5倍量水不浸泡，回流提取0.5 h，趁热过滤；(2)药渣再加4倍量水回流提取0.5 h，趁热过滤，并将滤液合并；(3)高剂量组浓缩至每1 mL含生药1.24 g，低剂量组稀释至每1 mL含生药0.31 g[4]。阳性对照组药物选用水飞蓟宾葡甲胺片(江苏中兴药业有限公司，批号：H32026145，0.5 mg/片)。

1.1.3 试剂及耗材 食用玉米油(上海益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司，生产标准号：SC10161048100337)；CCl4分析纯(恒兴试剂，批号：20120211)；HE染色试剂盒(Solarbio，批号：G1120)；Masson染色试剂盒(Solarbio，批号：G1343)；RIPA裂解液(Solarbio，批号：20200730)；BCA试剂盒(Solarbio，批号：20200817)；羟脯氨酸(HYP)碱水解法检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号A030-2-1)；AST、ALT、Alb和总蛋白使用全自动生化仪配套试剂检测(ROCHE，批号：56902901，57938901，57927501，57378001)；Wnt1兔抗单克隆抗体(GeneTex，批号：GTX105955)；β-Catenin兔抗单克隆抗体(GeneTex，批号：GTX101435)；Cyclin D1兔抗单克隆抗体(GeneTex，批号：GTX108624)；GAPDH兔抗多克隆抗体(ImmunoWay，批号：YM3215)；ECL化学发光超敏显色试剂盒(YEASEN，批号：S2018081)；RNA纯化试剂盒(TaKaRa，批号：9767)；荧光定量试剂盒(TaKaRa，批号：RR820A)；反转录试剂盒(TaKaRa，批号：RR047A)。

1.1.4 主要仪器 全自动组织脱水切片机(Leica Biosystems，CM3050S)；显微镜及图像采集系统(OLYMPUS，BX53)；全自动生化分析仪(ROCHE，COBAS C311)；实时荧光定量PCR系统(Bio-Rad，CFX96)；电泳仪(BIO-RAD，041BR 109973)；全能型蛋白转印系统(Bio-Rad，Trans-Blot Turbo)；全能型成像系统(Bio-Rad ，Chemi Doc MP)；酶标仪(Bio-Rad，Mark1509)，精密电子天平(OHAUS，AR224CN)。

1.2 动物分组、造模及药物干预 60只Wistar大鼠使用简单随机化分组法分为空白对照组、模型组、阳性对照组和舒肝和络醒脾方高、中、低剂量组6组，每组10只。分组法如下操作：(1)将60只大鼠从1～60编号；(2)绘制随机数字表，从数字表中任意数字开始，以同一方向顺序得到每只大鼠的随机数字；(3)随机数除以组数求余数，整除则余数取组数；(4)按余数分组；(5)调整[5]。分组后，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射1.0 mL/kg的40%CCl4玉米油溶液，每周2次，持续8周[6]。肝纤维大鼠模型成功的标志为：肝组织HE切片能观察到明显纤维间隔形成[7]。空白对照组和模型组给予10 mL/kg生理盐水灌胃，阳性对照组用水飞蓟宾葡甲胺溶液50 mg/kg灌胃，舒肝和络醒脾方高、中、低剂量组分别按12.42 g/kg、6.21 g/kg和3.11 g/kg(生药/体质量)灌胃，每日1次，持续8周。给药量计算方法参照《实验药理方法学》[8]，大鼠剂量=人临床剂量/70 kg×6.3。末次给药后次日，大鼠以45 mg/kg体质量腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉。腹主动脉穿刺取血后，离心取血清，-80 ℃保存备用。于肝右叶切取肝组织(1 cm×1 cm×1 cm)浸于4%多聚甲醛固定液中做预切片处理；取肝左叶组织(1 cm×1 cm×1 cm)用于提取总蛋白和总RNA。

1.3 研究方法

1.3.1 大鼠生理状况的观察 每日观察大鼠生长、进食、饮水、毛色、粪便、尿量及颜色、活动、死亡情况。使用精密电子天平每周称量并记录各大鼠体质量。

1.3.2 血液学指标检测 取大鼠腹主动脉血血清用碱水解比色法检测大鼠血清中HYP含量，于全自动生化分析仪检测大鼠AST、ALT、总蛋白、Alb指标水平。

1.3.3 肝组织病理学观察 取甲醛固定的部分肝脏脱水、石蜡包埋、切片后做常规HE染色与Masson染色。常规HE染色评估采用镜下观察方法，每张切片选取3个不同视野，观察纤维化程度，综合参考临床肝炎分级和肝纤维化分期标准对肝脏损伤程度进行评分，评分越高代表肝纤维化程度越严重(表1)[1]。

表1 慢性肝炎分级和肝纤维化分期标准

Masson染色切片评估采用胶原容积分数半定量分析法。每张切片选取3个不同视野，使用Image-pro Plus 6.0软件选取相同的绿色作为判断所有照片胶原纤维的统一标准，分析得出胶原纤维占整个组织面积的比率即胶原纤维的面积百分比(%)[9]。

1.3.4 RT-qPCR法检测肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA的表达 取肝组织100 mg，液氮速冻后研磨，使用RNA纯化试剂盒提取总RNA，RT-q PCR检测Wnt1，β-Catenin和Cyclin D1的mRNA水平。取2 μg RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板，按qPCR试剂盒说明书扩增。根据 qPCR所得的Ct值，以β-actin为内参计算2-ΔΔCt，计算结果以空白对照组表达水平进行归一化处理。PCR引物由北京擎科生物科技有限公司设计合成(表2)。

1.3.5 Western blot法检测肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1蛋白的表达 取肝组织100 mg，粗剪碎加入RIPA裂解液，经4 ℃低温高速离心机12 000 r/min，30 min离心后取上清液进行BCA法蛋白浓度测定以计算上样量后加入4×loading buffer 上样缓冲液，使用振荡恒温金属浴100 ℃煮沸10 min变性。根据Western blot标准操作步骤依次进行电泳、转膜、封闭，分别孵育Wnt1(1∶2000)、β-Catenin(1∶2000)、Cyclin D1(1∶2000)和内参蛋白GAPDH(1∶2000)，ECL发光显影，凝胶成像，使用Image J与GraphPad Prism 9.0软件进行Wnt1、β-Catenin、Cyclin D1及GAPDH 显影条带的相对灰度值分析。

表2 PCR引物列表

2 结果

2.1 舒肝和络醒脾方对大鼠生理状况的影响 造模过程中，空白组大鼠无死亡，余10只；模型组死亡4只，余6只；阳性对照组死亡1只，余9只；舒肝和络醒脾方高剂量组死亡1只，余9只；舒肝和络醒脾方中剂量组死亡2只，余8只；舒肝和络醒脾方低剂量组死亡3只，余7只。经观察，空白对照组大鼠，体质量正常，皮毛光泽，食量正常，活动灵敏，健康状况良好。模型组大鼠明显消瘦，体质量减轻，毛色暗淡，精神不佳，进食进水少，粪便溏稀，尿色发黄。阳性对照组与舒肝和络醒脾方组大鼠精神状态尚可，活动度有所增加，反应较快，进食、饮水、毛色、粪便、尿量及皮毛光泽度有所改善，其中舒肝和络醒脾方高、中剂量组效果较为明显。

2.2 舒肝和络醒脾方对大鼠肝组织血液学指标的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清中HYP、ALT、AST和Glo水平显著升高(P值均<0.05)，总蛋白、Alb和Alb/Glo(A/G)水平明显降低(P值均<0.05)，提示造模成功。与模型组比较，阳性对照组和舒肝和络醒脾方干预后大鼠血清中HYP、ALT、AST和Glo水平显著降低(P值均<0.05)，总蛋白、Alb和A/G水平明显升高(P值均<0.05)；与阳性对照组比较，舒肝和络醒脾方低剂量组的ALT、 AST水平显著升高(P值均<0.05)，总蛋白、Alb和A/G水平明显降低(P值均<0.05)。上述结果提示，舒肝和络醒脾方和水飞蓟宾葡甲胺对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠的肝损伤具有保护作用，对大鼠的胶原蛋白分解代谢功能具有促进作用，且提示水飞蓟宾葡甲胺效果比舒肝和络醒脾方低剂量显著，但舒肝和络醒脾方高、中剂量效果与水飞蓟宾葡甲胺基本等效(表3、4)。

2.3 舒肝和络醒脾方对肝脏病理学结构变化的影响及肝损伤程度评分 HE染色显示：空白对照组大鼠肝脏分为6叶，色暗红，边角锐利，质地柔软；肝小叶结构清晰，肝索及肝窦围绕中央静脉呈放射状排列；模型组大鼠肝脏颜色变浅，边角变钝，质地变韧，并出现大小不等的结节，可见门静脉中度纤维化伴大量纤维间隔，肝小叶内纤维结缔组织弥漫增生形成纤维间隔，小叶周围及汇管区可见变性坏死的肝细胞，形成假小叶；与模型组比较，各用药组大鼠肝脏纤维结缔组织增生、分割明显减轻，肝小叶轮廓相对清晰，肝细胞变性坏死程度减轻，肝脏形态、颜色和质地接近正常；阳性对照组可见门静脉轻度纤维化伴少量纤维间隔，肝细胞轻微脂肪变；舒肝和络醒脾方低剂量组可见明显门静脉纤维化伴少量纤维间隔；舒肝和络醒脾方中剂量组可见少量门静脉轻微纤维化；舒肝和络醒脾方高剂量组未观察到明显异常(图1，表5)。Masson染色显示：空白对照组仅汇管区血管有少量胶原沉积；模型组肝组织门静脉中度纤维化伴大量纤维间隔，汇管区可见明显纤维间隔，肝小叶结构破坏，并形成假小叶，胶原沉积显著增多(P<0.05)；与模型组比较，舒肝和络醒脾方低剂量组虽然能有效减少胶原沉积(P<0.05)，但仍可观察到明显的门静脉纤维化伴少量纤维间隔和假小叶，其余各药物干预组纤维化程度均明显减轻，胶原沉积显著减少(P<0.05)；与阳性对照组比较，舒肝和洛醒脾方高剂量组胶原沉积的治疗效果方面优于水飞蓟宾葡甲胺组舒肝和络醒脾方中、低剂量组(P值均<0.05)，与舒肝和络醒脾方高剂量组基本等效(图2，表6)。上述结果提示，舒肝和络醒脾方能够明显改善肝纤维化大鼠肝组织病理改变及纤维化程度。舒肝和络醒脾和低剂量具有轻微药效作用，舒肝和络醒脾方中剂量和水飞蓟宾葡甲胺具有一定治疗作用，舒肝和络醒脾方高剂量具有明显药效作用。

2.4 舒肝和络醒脾方对大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA水平的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1mRNA表达水平显著升高(P值均<0.05)；与模型组比较，各药物治疗组大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA的水平显著降低(P值均<0.05)。上述结果提示，水飞蓟宾葡甲胺和舒肝和络醒脾方对于调控Wnt/β-Catenin信号通路的关键配体Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA表达水平有显著作用，且各药物治疗组效果无明显差异(表7)。

表3 各组HYP、ALT、AST表达水平比较

表4 各组TP、Alb、Glo和A/G表达水平比较

注：a,正常对照组；b,模型组；c,阳性对照组；d,舒肝和络醒脾方高剂量组；e,舒肝和络醒脾方中剂量组；f,舒肝和络醒脾方低剂量组。

注：a,正常对照组；b,模型组；c,阳性对照组；d,舒肝和络醒脾方高剂量组；e,舒肝和络醒脾方中剂量组；f,舒肝和络醒脾方低剂量组。

2.5 舒肝和络醒脾方对大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin、Cyclin D1蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1蛋白的表达水平均显著升高(P值均<0.05)；与模型组比较，除舒肝和络醒脾方低剂量组外，其余各治疗组肝组织中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的蛋白表达水平显著降低(P值均<0.05)；与阳性对照组比较，舒肝和络醒脾方中、低剂量组在β-Catenin蛋白水平表达上显著升高(P值均<0.05)。上述结果提示，水飞蓟宾葡甲胺和舒肝和络醒脾方高、中剂量能够抑制CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的蛋白表达水平，且提示水飞蓟宾葡甲胺与舒肝和络醒脾方高剂量对于该通路关键蛋白 β-Catenin调控作用优于舒肝和络醒脾方中剂量(图3，表8)。

表5 各组HE染色切片分级及评分

表6 各组Masson染色切片肝纤维化分级及胶原容积分数半定量分析结果

表7 各组大鼠肝组织中Wnt1、β-Catenin和 CyclinD1 mRNA 的表达

表8 各组大鼠组织Wnt1、β-Catenin和 CyclinD1 蛋白表达水平比较

注：空白，空白对照组；模型，模型组；阳性，阳性对照组；高，舒肝和络醒脾方高剂量组；中，舒肝和络醒脾方中剂量组；低，舒肝和络醒脾方低剂量组。

3 讨论

肝纤维化是所有慢性肝病共同的病理基础。临床上，肝硬化导致的腹水、上消化道出血、肝衰竭、肝细胞癌等均为肝纤维化的显性表达。虽然肝纤维化的发病机制尚未完全阐明，但主要是由于“慢性肝损伤-促静息肝星状细胞转化肌成纤维细胞和细胞外过度沉积的发生-导致肝纤维化病理变化”。肝纤维化于中医属“胁痛”“积聚”“肝着”等病症范畴。甘肃省国医大师周信有教授基于“肝藏血”“脾统血”“久病入络”和“肝体阴用阳”理论，将现代医学的“慢性肝损伤-肝纤维化-肝硬化形成”疾病进展提炼为中医学“络脉瘀滞-微小癥积-癥积形成”的理论，提出“益气养血、祛瘀活络、舒肝醒脾”的治疗大法，即“舒肝和络醒脾法”学说，且结合临床验效拟专方舒肝和络醒脾方。该方由醋柴胡，岷当归，炙黄芪，莪术，鳖甲，枳椇子六味药构成，以醋柴胡舒肝行气，岷当归养血和络，炙黄芪益气扶正，鳖甲去痞除癥，莪术破血通络，枳椇子醒脾解毒，共奏舒肝醒脾、祛瘀活络、益气养血之功效。针对肝纤维化络脉瘀滞、肝郁脾困，气血失和，进而形成微小癥积的病机和证候要素，辨证施治，临床确有良效[10]。临床研究[11-13]表明，该方能够有效改善肝纤维化患者临床症状，并促进肝功能恢复。已完成的基础研究[4]证实，舒肝和络醒脾方能够显著降低CCl4诱导肝纤维化大鼠的透明质酸、Ⅳ型胶原和肝瞬时弹性成像指数水平，以发挥抗纤维化治疗作用。

由于无论是肝纤维化发病的分子机制，还是Wnt/β-Catenin信号通路的转导机制均暗合“舒肝和络醒脾法”学说的学术思想，为了进一步揭示舒肝和络醒脾方的抗肝纤维化机制，印证“舒肝和络醒脾法”学说的科学性，本课题组检测了与肝纤维化进展密切相关的经典信号通路Wnt/β-Catenin的主要相关蛋白。Wnt信号通路在HSC的激活和肝纤维化发生发展中起到重要作用。Wnt1是肝损伤后激活的细胞因子，可导致β-Catenin大量聚集，促进HSC的活化[14]。β-Catenin的活性可以促进肝脏修复反应和疾病的发展，β-Catenin的表达水平越高，肝纤维化程度越高，沉默β-Catenin可以抑制胶原的分泌和HSC的增殖，介导细胞凋亡[15]。大量游离的β-Catenin到细胞核后能促进Wnt靶基因的转录，并激活细胞周期蛋白Cyclin D1。Cyclin D1对细胞周期的正调控会加速活化HSC的增殖，当Cyclin D1表达被抑制时HSC的增殖也受到抑制，发生凋亡[16]。临床常通过血液学指标联合病理学诊断(HE染色、Masson染色)确定肝纤维化。血液学指标分为直接型指标和间接型指标，直接指标HYP作为胶原组织的主要成分可以衡量体内胶原含量，反映纤维化程度。间接指标如ALT、AST可反映肝实质损害指标水平，与肝脏合成功能指标总蛋白、Alb和Glo协同参照，可作为评价肝功能和纤维化水平的间接评价指标[1]。

本研究采用水飞蓟宾葡甲胺和不同剂量的舒肝和络醒脾方对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠进行干预，结果显示，舒肝和络醒脾方和水飞蓟宾葡甲胺能够发挥显著的抗肝纤维化治疗作用。其中，舒肝和络醒脾方高剂量能够明显改善大鼠的生理状况、肝功能、肝脏的胶原蛋白分解代谢水平和肝组织病理改变及纤维化程度，且与水飞蓟宾葡甲胺基本等效，治疗效果优于舒肝和络醒脾方中、低剂量。在调控信号通路Wnt/β-Catenin主要蛋白Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA水平和蛋白表达方面，舒肝和络醒脾方高剂量对于关键蛋白 β-Catenin调控作用明显优于舒肝和络醒脾方中、低剂量，且与水飞蓟宾葡甲胺基本等效。上述结果提示，舒肝和络醒脾方的抗肝纤维化作用可能与抑制Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白活化有关，且以舒肝和络醒脾方高剂量效果最为明显，与戴琦等[17]益气活血利水汤抑制慢性肝纤维化的研究结果较为一致。上述结果也提示，肝纤维化发病的分子机制和Wnt/β-Catenin信号通路的转导机制均符合“舒肝和络醒脾法”学说的学术思想，验证了学说的科学性和有效性。

本研究的创新之处在基于“舒肝和络醒脾法”学说，把握肝纤维化络脉瘀滞、肝郁脾困，气血失和，进而形成微小癥积的病机和证候要素，遵循扶正祛邪的总则，以舒肝醒脾、祛瘀活络、益气养血立法，创立舒肝和络醒脾方，在基础及临床研究中均证实本方能有效发挥抗肝纤维化治疗作用，印证了“舒肝和络醒脾法”学说的科学性和有效性。应用中医药复方干预肝络微小癥积的发展，亦体现了中医学“治未病”的思想。本实验虽然从生理学、病理学和血液学方面验证了舒肝和络醒脾方的抗肝纤维化治疗作用，并初步了解其抗纤维化机制可能是通过调控Wnt/β-Catenin信号通路发挥作用，但由于复方中药成分的复杂性，是否有其他信号通路参与仍需进一步验证，且舒肝和络醒脾方对于脾脏血液动力学及免疫功能是否具有调控作用仍需进一步探索。

伦理学声明：本研究方案于2019年3月8日经由甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审批，批号：2019-140，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：王奎淞负责课题设计，资料分析，撰写论文；魏书瑶、殷世鹏、李婕妠、陈世玉、郭嘉琪参与收集数据，修改论文；赵鲲鹏、张秋菊负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。