2019年浙江省部分地区小麦赤霉病菌种群组成及其对杀菌剂的敏感性调查

赵心雨，郭宇燕，张 璐，赖朝晖，黄福旦，胡东维，梁五生

(1.浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所/农业部作物病虫分子生物学重点实验室/浙江省作物病虫生物学重点实验室，浙江杭州 310058；2.浙江省象山县农业技术推广中心，浙江象山 315700；3.浙江省杭州市萧山区农业技术推广中心，浙江杭州 311203)

赤霉病(Fusarium head blight)是由赤霉病菌侵染小麦引起的一种常见真菌性病害，可导致麦穗枯萎，在世界范围内各麦区广泛发生，可造成小麦严重减产。赤霉病菌为一类镰孢菌复合种，包含禾谷镰孢菌()、亚洲镰孢菌()、梨孢镰孢菌()等多种镰孢菌，目前已鉴定出23种镰孢菌。不同的镰孢菌产生不同的毒素，不同的毒素具有不同的毒性，根据产毒类型可将镰孢菌产生的毒素分为不同的毒素化学型。此外，不同镰孢菌的侵染方式、产孢作用以及对杀菌剂的敏感性等均存在差异。由于气候条件、耕种方式等方面的影响，不同地区赤霉病菌的种群组成可能不同，鉴定不同麦区赤霉病菌菌株的种群组成，可为在气候变化大背景下调整轮作方式、预测评估风险等提供依据。

小麦是浙江省第二大粮食作物，赤霉病一直严重影响浙江省的小麦生产。1954―1977年中，小麦赤霉病中、重病年份占70%以上。2006―2015年间的统计数据显示，小麦赤霉病在浙江省偏重流行，其中2012、2014和2016年浙江省发生较为严重。因此，该病在浙江省长期偏重流行的原因值得深入研究。

对于浙江省小麦赤霉病菌的种群组成，虽然目前已有研究报道，但鉴定时间较早。因此，本研究于2019年对浙江省部分地区小麦赤霉病菌的种群组成进行分析，并调查其对杀菌剂的敏感性，以期为科学防病控病提供依据。

1 材料与方法

1.1 田间稻桩赤霉病菌子囊壳阳性率的调查及其孢子萌发活性的检测

于2019年3月份，在浙江省3个地区(杭州市萧山区、杭州市桐庐县、宁波市象山县)的麦田，随机拔取一定数量上一年种植水稻收割后遗留的稻桩，逐一检查稻桩上是否存在赤霉病菌子囊壳，统计阳性稻桩的数量并计算阳性率。随机抽取部分阳性稻桩，带回实验室，用镊子夹取若干子囊壳置于载玻片上，挤压使其破裂，加无菌水悬浮，吸取部分悬浮液涂布于PDA培养基平板上。将载有子囊壳悬浮液的载玻片和涂布子囊壳悬浮液的PDA平板均静置于25 ℃培养箱中，每隔2 h观察PDA平板上的菌落生长情况，并用光学显微镜观察载玻片上孢子的萌发情况，检测子囊壳中孢子的萌发活性。

1.2 田间空气中赤霉病菌游动孢子数量的调查

于2019年3-5月，在3个地区麦田，取灭过菌的直径为9.0 cm的培养皿，加适量灭菌水(约7 mL，以淹没培养皿底部为标准)，开盖后置于离麦田地面约1.5 m的高度处，捕获空气中的赤霉病菌游动孢子。每月调查一次，三次调查中每个地点随机放置10套培养皿，记录捕获时间，2～4 h后盖好皿盖，带回实验室，在无菌操作台上先加入适量链霉素以防止细菌污染，再加入10 mL PDA固体培养基，然后置于25 ℃恒温箱中培养，3 d后观察PDA平板并统计各平板上具有苋菜红特征的菌落数量，即为捕获的空气中赤霉病菌游动孢子数量。

1.3 田间小麦赤霉病病穗率的调查

于2019年4月上旬(4月10日)、中旬(4月16日)和下旬(4月27日)，调查3个地区麦田小麦(以扬麦20、扬麦24为主导品种)的赤霉病病穗率，病穗的判定标准为麦穗上至少有1个麦粒的外壳被明显漂白。每个地区每次至少调查3个不同田块，每个田块至少随机调查100个麦穗。

1.4 赤霉病菌菌株的分离

于2019年4月，从3个地区的麦田随机采集小麦病穗，带回实验室，参考史文琦等的单孢分离方法，获得纯化菌株，逐一编号、保存。

1.5 赤霉病菌种群组成的鉴定

从分离的小麦赤霉病菌菌株中随机选择32个，参考Geiser等的方法，通过比对()基因的序列来鉴定分离到的赤霉病菌菌株的种名。具体方法：先用基因组提取试剂盒(上海生工生物科技有限公司)提取菌株的基因组DNA。然后以基因组DNA为模板，用引物EF-1[5′-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3′]和EF-2[5′-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3′]进行扩增。PCR反应体系为20 μL，包含DNA模板1 μL， 2×HieffPCR Master Mix(with Dye)(上海翌圣生物科技有限公司)10 μL，EF-1(10 μmmol·L) 1 μL，EF-2(10 μmmol·L) 1 μL，ddHO 7 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收并纯化目的片段，送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司测序。将所得到的基因序列与NCBI数据库中的序列进行比对，确定分离到的赤霉病菌菌株的种名。

1.6 赤霉病菌对多菌灵抗性的检测

参考王建新等的方法，分别配制不含多菌灵和含10 mg·L多菌灵的PDA培养基平板，先用不含多菌灵的PDA平板培养赤霉病菌，然后从菌落边缘切取菌碟，接种于含多菌灵的PDA培养基平板中央，置于培养箱中在25 ℃下培养 3 d，每个菌株平行重复3皿，在含多菌灵的PDA平板上均能生长的菌株被认定为多菌灵的抗性菌株。

1.7 四种杀菌药剂有效抑制赤霉病菌中浓度(EC50)的测定

测定的四种杀菌药剂分别为75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂(拜耳股份有限公司)、40%戊唑·咪鲜胺水乳剂(佛山市盈辉作物科学有限公司)、30%唑醚·戊唑醇悬浮剂(江苏生久农化有限公司)和25%氰烯菌酯悬浮剂(江苏省农药研究所股份有限公司)。参考王建新等的菌落直径法，测定上述4种杀菌药剂对分离到的赤霉病菌菌株的EC。每种杀菌药剂均测定16个分离菌株，包括前期试验鉴定到的8个多菌灵抗性菌株和8个非抗性菌株。

1.8 杀菌药剂按不同方案混配后对赤霉病菌抑制效果的比较

利用已测定的EC浓度数值，分别配制含上述4种杀菌药剂中任意2种的PDA培养基平板，每种杀菌药剂的浓度是其EC值的50%，共得到6种杀菌药剂混配PDA培养基平板。然后参考王建新等报道的杀菌药剂EC值测定方法，并取其所用的16个分离菌株，测定各混配方案对病菌生长的抑制率。

2 结果与分析

2.1 田间稻桩的赤霉病菌子囊壳携带率及子囊孢子的萌发活性

2019年3月，小麦拔节期3个地区麦田均可见到稻桩残留，抽样调查的结果(表1)显示，3个地区麦田稻桩的赤霉病菌子囊壳携带率有一定差异，变化范围为26.4%～55.4%，平均值为43.9%。

表1 田间检出赤霉病菌子囊壳的稻桩百分率Table 1 Percentages of rice stubbles with perithecia of Fusarium spp. in the fields

将稻桩上的赤霉病菌子囊壳挤压破裂后制备悬浮液，吸取部分悬浮液涂布于载玻片上，用光学显微镜可观察到纺锤形子囊孢子，无色，隔膜为 1～3个，未萌发子囊孢子的长度可达约30 μm(图1A)。将涂布子囊壳悬浮液的载玻片置于 25 ℃培养箱中培养2 h，可观察到部分子囊孢子已长出芽管，表明部分孢子已经开始萌发(图1B)；培养6 h后，部分芽管伸长成菌丝(图1C)；继续培养14和18 h，可观察到从子囊孢子上长出的菌丝进一步伸长(图1D、1E)。取部分子囊壳制备的悬浮液涂布于PDA平板上，置于25 ℃培养箱中培养2 d，可观察到具有苋菜红特征的赤霉病菌菌落(图1F、1G)。上述孢子萌发试验结果表明，在合适的条件下，田间稻桩赤霉病菌子囊壳中的子囊孢子能够正常萌发长出菌丝，菌丝可快速生长形成菌落。

A～E分别为子囊孢子在载玻片上培养0、2、6、14和18 h后的图片。F和G分别为子囊孢子在PDA平板上培养2 d后形成的菌落正面照片和背面照片。

2.2 田间空气中赤霉病菌的游动孢子数

2019年3月，每个培养皿平均每小时从3个地区的麦田空气中捕获到的赤霉病菌游动孢子数平均值为6.7个；2019年4月和5月捕获到的赤霉病菌游动孢子数平均值均为1.6个，显著少于3月(表2)。

2.3 田间小麦的赤霉病病穗率

2019年4月上、中、下旬，调查3个地区田间小麦的赤霉病病穗率，结果(表3)显示，4月中旬田间小麦开始出现病穗，然后病穗率快速攀升，4月下旬有12.3%的麦穗表现出赤霉病症状。

2.4 赤霉病菌的种群组成

从3个地区的小麦病穗中共分离到386个赤霉病菌菌株，随机选择32个菌株进行PCR鉴定，结果显示，32个菌株均可扩增到大小约700 bp的目的片段，其中16个菌株PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。将上述目的片段回收纯化后，送北京擎科生物科技有限公司杭州分公司进行测序，结果显示，检测的32个分离菌株均为亚洲镰孢菌()，序列相似度均为100%，表明是3个地区赤霉病菌的优势种。

2.5 赤霉病菌分离菌株对多菌灵的抗性

对分离到的386个赤霉病菌菌株的多菌灵抗性进行检测，发现菌株在含10 mg·L多菌灵的PDA平板培养3 d后，314个菌株的菌落未见任何扩展，为非抗性菌株，如图3中的菌株1、2、3，占所有分离菌株的81.35%；另外72个菌株的菌落有所扩展，为抗性菌株，如图3中的菌株4、5、6，占所有分离菌株的18.65%。

2.6 赤霉病菌分离菌株对杀菌药剂的敏感性

选取目前市场主推的4种杀菌药剂(75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、40%戊唑·咪鲜胺微乳剂、30%唑醚·戊唑醇悬浮剂、25%氰烯菌酯悬浮剂)对分离到的16个赤霉病菌菌株(8个抗性菌株和8个非抗性菌株)的EC值进行测定，发现8个抗性菌株和8个非抗性菌株的EC值无统计学差异，因此取所有16个分离菌株的EC值平均值作为各杀菌药剂的EC值。从表4可以看出，75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂和30%唑醚·戊唑醇悬浮剂对分离到的16个赤霉病菌菌株的EC值均低于5.0 mg·L，40%戊唑·咪鲜胺微乳剂和25%氰烯菌酯悬浮剂对分离到的16个赤霉病菌菌株的EC值均低于2.0 μL·L，表明上述4种杀菌药剂对浙江赤霉病菌株均具有良好的抑菌效果。

表2 不同时期从麦田空气中捕获到的赤霉病菌的游动孢子数(2019)Table 2 Number of zoospores of Fusarium spp. trapped from the wheat fields air at different stages(2019)

进一步将上述4种杀菌药剂进行两两混配，然后测定16个赤霉病菌菌株的抑菌效果，结果(表5)显示，混配方案“75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂”+“30%唑醚·戊唑醇悬浮剂”的抑菌率最高。

表3 不同时期田间小麦的赤霉病病穗率(2019)Table 3 Percentage of diseased spikes with Fusarium head blight in the fields at different stages(2019)

M:DL1500；W：H2O(阴性对照)；1～16：16个分离菌株。

表4 四种杀菌药剂对赤霉病菌分离菌株的EC50值Table 4 EC50 values of four fungicidal agents to the isolated strains of Fusarium spp.

图3 分离到的赤霉病菌菌株对多菌灵的抗性表现

表5 四种杀菌剂两两混配方案对赤霉病菌菌丝生长的抑制率Table 5 Inhibition rates of pairwise mixing four tested fungicidal agents on the mycelial growth of the isolated strains of Fusarium spp. %

3 讨 论

3.1 田间的赤霉病菌子囊孢子的释放

Karlsson等研究证实，农田残留物上的孢子是小麦赤霉病重要的侵染源。本研究结果表明，3月份浙江省田间大部分稻桩都携带赤霉病菌子囊壳，其释放的子囊孢子在合适的条件下能快速萌发长成菌落。浙江省地处典型的亚热带季风气候区，四季分明，冬季气温偏低，赤霉病菌以子囊壳越冬。到了3月份，浙江省气温快速回升，降雨量也比冬季明显增多，因此子囊壳开始释放孢子。浙江省属冬小麦产区，大部分小麦于4月上旬开始抽穗，此时病穗率为零，表明新穗不带病原菌。小麦从齐穗期至灌浆初期，尤其是盛花末期，是赤霉病菌最易侵染麦穗的时期。本研究结果表明，4月中旬开始出现病穗，随后病穗率快速攀升，推测这些病穗是由4月份田间稻桩赤霉病子囊壳释放的孢子侵染麦穗后产生的。捕获结果显示，3月份浙江省麦田空气中赤霉病菌游动孢子数约是4月份和5月份的4倍，表明赤霉病菌子囊孢子主要在3月份释放。3月份释放的赤霉病菌孢子是否可侵染小麦或其他寄主而产生次生孢子，继而在4-5月份参与侵染麦穗，尚不 清楚。

3.2 赤霉病菌种群的组成

国内外学者研究表明，不同地区小麦赤霉病菌的种群组成存在差异，国内菌株主要为和，其中为北方地区的优势种，为南方地区的优势种。气温和耕作制度(包括轮作方式)是影响小麦赤霉病菌种群组成的重要因素。陈鸿逵等从浙江省采集到的500个赤霉病穗样品中，发现478个病穗可鉴定到，占比93.9%，不过样品包括大麦和小麦的病穗；Gale等从浙江省4个地区采集的病穗种共分离到225个菌株，鉴定结果全部为；Qu等从分离到的437个赤霉病菌菌株中，发现57个采自浙江省的菌株被鉴定为；Zhang等在分离到的469个菌株中，发现有30个采自浙江，其中26个被鉴定为，4个被鉴定为。本研究结果表明，是浙江省3个地区(杭州市萧山区、桐庐县以及宁波市象山县)赤霉病菌的优势种。此结论与陈鸿逵等和Gale等的鉴定结论不一致，但与Qu等和Zhang等的鉴定结论一致。此观点也与上述为中国南方地区优势种这一规律相符。

3.3 赤霉病菌菌株对多菌灵的抗性频率

目前杀菌药剂仍是生产实践中防治小麦赤霉病的重要武器，其中多菌灵已被长期广泛使用，这已导致田间多菌灵抗性菌株的产生。周明国等于1992年在浙江省海宁市采集的405个小麦病穗上分离到1个抗性菌株，抗性频率约为0.25%；次年在该市采集的802个小麦病穗上分离到10个抗性菌株，抗性频率约为1.25%。本研究测定了从浙江麦田分离到的386个赤霉病菌菌株，结果发现有72个抗性菌株，抗性频率为18.65%。此抗性频率低于近期江苏样品的检测结果(26.3%～54.5%)，但明显高于近期湖北样品的检测结果(3%)；与1993年浙江省海宁市样品的抗性频率(1.25%)相比，已增长近14倍。

3.4 赤霉病菌菌株对4种杀菌药剂的敏感性

鉴于浙江省赤霉菌株对多菌灵的抗性频率已近二成，在生产上应减少多菌灵在小麦赤霉病防控中的应用，应选择不含多菌灵的杀菌药剂。为此本研究测试了目前市场主推的4种不含多菌灵的杀菌药剂对浙江省赤霉病菌菌株的抑菌效果，结果表明，这4种药剂的抑菌效果均良好。劳晓梅等和方志峰等应用40%戊唑·咪鲜胺水乳剂分别在浙江省嘉兴市和海宁市麦田，翁俊雄应用30%唑醚·戊唑醇悬浮剂在浙江省绍兴市麦田，均发现对防治小麦赤霉病有较好的抑菌效果，与本研究试验得到的结论一致。

本研究还分析了杀菌药剂两两混配对赤霉病菌菌株的抑菌效果，结果显示，混配方案“75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂”+“30%唑醚·戊唑醇悬浮剂”的抑菌率最高。这两种杀菌药剂都含有戊唑醇，此外还分别含有肟菌酯和吡唑醚菌酯，肟菌酯和吡唑醚菌酯都是线粒体呼吸链抑制剂，推测这两种杀菌药剂可通过抑制细胞呼吸来抑制真菌生长。