3个粒重基因在青海高原春小麦品种中的分布

张业猛，朱丽丽，郭仁世，邢 瑜，马德林，陈志国，刘德梅，王海庆

(1.中国科学院大学，北京 100039； 2.中国科学院西北高原生物研究所/中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，青海西宁 810008； 3.青海省农作物种子站，青海西宁 810003)

中国作为世界上最大的小麦生产国和消费大国，小麦产量直接影响粮食安全。因此，培育高产、稳产、优质新品种是目前小麦育种的主要目标之一。粒重作为小麦产量三要素之一，其性状相对稳定，主要受粒重基因加性效应的影响。虽然近年来中国不同小麦生态区审定的品种粒重均有不同程度的提升，但关于小麦粒重基因标记的开发和利用仍不够广泛和深入。青海是中国小麦高产区，高粒重是该地区小麦实现高产的重要因素之一。李红琴等对青海省1957―2009年审定的春小麦品种的千粒重进行分析，发现66个品种的平均千粒重为45.91 g，20世纪90年代小麦品种的千粒重最大，为46.95 g，2000年以后略有下降，呈先升高后降低的趋势，变异系数为12.57%。因此，结合分子标记辅助选择技术开展青海省小麦的粒重育种很有必要。

分子标记辅助选择技术能够加速育种进程，提高选择效率，已广泛应用于多种作物育种中，为优良基因型的选择和聚合杂交育种提供了技术支撑。Hanif等在小麦中克隆到基因，并开发出功能标记TaTGW6-A1-CAPS，用于检测该基因的两个等位变异和，并发现相较于，具有较高的粒重和产量。Ma等在小麦中克隆到基因，并开发出功能标记CW121和CW122，用于检测(与高千粒重相关)和(与低千粒重相关)。Zhang等在小麦中克隆到基因，并开发出功能标记GS7D，用于检测两个等位变异和，并发现相较于/和/基因型，/基因型表现出较高的千粒重。Ma等在小麦中克隆到和，其中具有4种等位变异()，其中与高千粒重相关，且在中国小麦品种中分布频率较高；而具有两个等位变异()，其中与高千粒重、少分蘖数相关，并据此开发了功能标记，用于检测这些等位变异。

竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)是利用通用荧光探针，针对广泛的基因组DNA样品，可以在短时间内准确判断目标SNPs和InDels，并进行精准的双等位基因分型，是较为便捷的分子手段之一。为提高多个粒重基因的聚合效率和精准度，了解现有原始材料的基因型很有必要。本研究利用Ramirez-gonzalez等公布的小麦KASP引物设计方法进行引物设计，对青海高原地区49个小麦品种(地方品种、生产上发挥过作用的外引品种、通过审定品种和历年主栽品种)的粒重基因变异类型进行检测，明确这些种质资源中粒重基因的等位变异分布，以期为开展分子设计和多基因聚合育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的49个小麦品种系本实验室自繁保留，审定信息来自《青海省农作物品种志》和中国种业大数据平台(http://202.127.42.145/bigdataNew/home/ManageOrg)，详细信息见表1。

1.2 田间种植和千粒重测定

2013-2015年，所有材料种植在青海省海西蒙古族藏族自治州香日德镇(36°3′52″ N， 97°47′45″ E，海拔 2 999 m)，每个品种种植5行，行长2 m，行距0.2 m，每行播50粒种子。田间管理同大田生产，正常成熟后人工收获，储藏 备用。

每份材料取100粒种子，利用德国GTA公司的种子成像分析仪(Marvin-U)进行粒径测定，3次重复。利用德国Pfeuffer公司的数粒仪(Contador N02)进行种子计数，每份材料取1 000粒种子，3次重复，然后采用便携式电子天平(感量0.01 g)进行千粒重测定。

表1 供试品种信息Table 1 Information of tested cultivars

1.3 DNA提取及KASP标记检测

每份材料选取大小均匀且籽粒饱满的3粒种子，采用CTAB法提取样本DNA，并经琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。使用美国Thermo公司的微量紫外分光光度计(Nano Drop 2000C)进行DNA浓度测定。

用于检测3个粒重基因(、和)不同等位变异的KASP引物由北京佩莱技术有限公司合成，引物序列见表2。FAM-primer 5′末端连接1个FAM荧光基团(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′)，HEX-primer 5′末端连接1个HEX荧光基团(5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′)。利用Bio-Rad CFX96 PCR 仪 (Bio-Rad，美国)进行 PCR扩增。PCR反应体系为10 μL，包括4.78 μL DNA (5～50 ng·μL)，5 μL KASP 5000 V4.0 2×Master Mix，0.14 μL KASP Assay Mix(上下游引物混合液)，0.08 μL Mg。PCR反应程序为降落PCR：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s，61～55 ℃复性1 min (每个循环下降0.6 ℃)，10个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃复性1 min，30个循环；4 ℃避光保存，采用Axiom Analysis Suite 软件进行分型。

1.4 数据统计

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，并对不同基因型小麦品种的千粒重表型进行差异显著性分析和方差分析(ANOVA)，并利用LSD法进行多重比较。

表2 本研究所用的KASP引物Table 2 KASP primers used in this study

2 结果与分析

2.1 粒重相关性状表型分析结果

2013-2015年，49个小麦品种的千粒重平均值分别为52.21、47.84和38.12 g，变化范围分别为36.97～67.03、32.14～63.12和22.51～ 58.80 g，变异系数分别为13.55%、 13.06%和21.02%。49个小麦品种的粒长平均值分别为 6.68、6.55和6.22 mm，变化范围分别为5.57～ 7.60 mm、5.58～7.64 mm和5.77～6.89 mm，变异系数分别为7.38%、7.12%和 3.73%。49个小麦品种的粒宽平均值分别为 3.45、3.36和3.38 mm，变化范围分别为2.97～3.77 mm、 2.89～3.66 mm和2.96～3.66 mm，变异系数分别为5.72%、5.54%和5.66%(表3)。进一步对不同来源品种的粒重相关性状进行比较，发现青海省育成品种的千粒重显著高于引进品种和地方品种，而青海省育成品种、引进品种和地方品种之间的粒宽和粒长无显著差异(表4)。

2.2 粒重基因不同等位变异的分布及其对粒重的影响

从表5可以看出，供试小麦品种中，、和基因位点上均发现2种等位变异。位点上，和等位变异的分布频率分别为69.39%和30.61%；位点上，和等位变异的分布频率分别为46.94%和53.06%；位点上，和等位变异的分布频率分别为97.96%和2.04%。3个基因位点的2种等位变异对粒宽和粒长均无显著影响，但对千粒重有显著影响。 携带、和等位变异类型品种的千粒重分别显著高于携带、和等位变异类型的品种，说明、和为优异等位变异。进一步对不同来源品种中优异等位变异的分布频率进行比较，发现和这两种等位变异在青海省育成品种和引进品种中的分布频率明显高于地方品种(表6)。

表3 不同年份间小麦粒重相关性状表型分析Table 3 Phenotypic analysis of grain weight related traits of wheat in different years

表4 不同来源小麦品种粒重相关性状的表型分析Table 4 Phenotypic analysis of grain weight related traits of wheat from different origins

表5 粒重基因的不同等位变异对小麦粒重相关性状的影响Table 5 Effect of alleles of different grain weight genes on grain wheat related traits of wheat

表6 不同来源小麦品种优势等位变异的分布频率Table 6 Distribution frequency of preponderant allelic variation of wheat from different origins

2.3 不同等位变异组合类型对小麦粒重的影响

从表7可以看出，供试小麦品种中，共发现5种等位变异组合类型，分布频率为2.04%～ 36.73%。综合2013-2015年的粒重相关表型数据，发现5种等位变异组合类型与千粒重显著相关，而与粒宽和粒长相关性不显著。组合类型为//(含有3种优异等位变异)的品种，千粒重显著高于其他组合类型的品种；组合类型为//和//(含有2种优异等位变异)的品种，之间千粒重无显著性差异，但显著高于组合类型为//(只含有1种优异等位变异)的品种。此外，//组合类型品种的千粒重低于//组合类型的品种，原因可能是//组合类型的品种只有1个，结果不具有代表性，也可能是其他因素影响，但还需进一步研究。总之，//等位变异组合类型为最优 组合。

表7 不同等位变异组合对小麦粒重相关性状的影响Table 7 Effect of allelic variation combination on grain wheat related traits in wheat cultivars

3 讨 论

长期以来，高产和稳产一直是小麦育种的最主要目标之一。随着分子标记辅助选择育种、基因编辑、染色体工程等现代育种技术的广泛应用，小麦粒重基因也得到了深入的研究，不断有新的粒重基因被克隆和定位，并创造出了较为优良的品种。目前，已克隆出、、、、、、等小麦粒重基因，并开发出相应的功能标记，可快速准确鉴定不同小麦品种中控制粒重的相关基因及其等位变异类型的分布情况。刘永伟等利用基因的功能标记CWI21和CWI22对539份黄淮麦区小麦品种(系)进行检测，发现等位变异的分布频率明显高于，且基因型材料的千粒重显著高于基因型，进一步证实为优异等位变异。简大为等利用52个功能标记对136份新疆小麦品种(系)的主要农艺性状相关基因进行检测，发现7个粒重基因的优异等位变异在改良品种中的分布频率明显高于地方品种，并且大部分优异等位变异的分布频率随着育种时期的推进呈上升趋势。

粒重和其他产量性状都是由多基因控制的综合性状，只从单基因入手进行分子标记辅助育种达不到全面提升小麦产量的目的，必须实现优势基因的聚合，才能实现培育高产小麦的目的。仝靖洋等对粒重相关基因的不同等位变异组合进行了分析，发现///为最优组合，其粒长和千粒重较其他变异组合均显著提高。张福彦等结合2个年度的千粒重表型，对、和基因的不同等位变异组合进行了分析，发现携带等位变异组合//的小麦品种千粒重最高，是优势基因型组合。赵俊杰发现，粒重基因的优异等位变异聚合可以提高品种的千粒重，但是对品种的穗粒数和有效分蘖无明显影响。

本研究利用KASP标记检测3个粒重基因、和在49个青海主栽小麦品种中的分布，结果表明，3个粒重基因在供试材料中均有分布，有5种等位变异组合类型，其中，携带3个优异等位变异组合 (//)材料的千粒重最高，为最优组合。在供试材料中并没有发现携带//、//和//组合的品种，并且同时携带3种劣势等位变异组合小麦品种的千粒重均值也不是最低，原因可能是其他变异组合类型品种较少，不具有代表性；也有可能是青海高原小麦生长后期，气温逐步下降，小麦籽粒整体灌浆期长，最终导致粒重较高；此外，粒重受多基因控制，其他粒重基因对小麦粒重也具有一定的补偿，也是造成这一现象的原因，但具体原因还需要进一步深入研究。陈丽华等对青海省推广种植的61个春小麦主栽品种的主要农艺性状进行分析，发现这些品种的千粒重平均值为37.9 g，主成分分析显示的4个主成分(产量因子、穗密度因子、粒数因子、粒重因子)的累积贡献率达 89.37%，粒重因子在青海高原春小麦产量贡献中占比较高，因此，开展粒重基因相关研究非常 必要。