具有抑菌活性植物乳杆菌细菌素生物稳定性研究

王虹军，田 星，陈芝娟

（杭州博日科技股份有限公司，浙江 杭州 310053）

乳酸菌是具有十分重要的益生功能的微生物，在其自身生长过程中能够代谢产生乳酸，改善过敏人群对乳制品的乳糖不耐症，还可以显著促进人体消化吸收能力，防止便秘[1]。乳酸菌对食品感官品质的提高也具有非常重要的作用，可以改善食品风味[2]。另外乳酸菌的代谢产物如有机酸、过氧化氢和细菌素等，能对引起食品腐败变质的微生物产生抑制作用[3]。因此，乳酸菌可作为益生菌被广泛地应用于食品工业中[4-5]。近年来，关于乳酸菌在不同行业、不同领域应用的研究越来越多，而且乳酸菌的其他生理功能也正在被进一步地开发利用。

现代社会消费者对食品安全问题关注度越来越高，尤其是防腐剂的使用。因此，开发无毒副作用、无化学残留、能够延长食品的储存期的生物防腐剂代替化学防腐剂的使用，是食品安全领域一个亟待解决的问题[6]。目前食品生产过程中，化学防腐剂的使用更加地普遍，但添加化学防腐剂可能导致食品原有风味的变化，也可能会危害人体健康。因此，从天然产物中获取安全无害的抑菌剂从而抑制腐败微生物引起的食品变质问题成为确保食品安全和货架寿命的创新途径。而乳酸菌在生长过程中的一些代谢产物如细菌素等具有较好的抑菌作用，因此乳酸菌成为具有潜在研究价值的无公害防腐剂[7]。

细菌素是乳酸菌在生长过程中代谢产生的能够抑制多种微生物的物质[8]。它成本低，生产快速，可对食物腐败菌起到抑制或杀灭作用，因此在食品、农业、医药中作用广泛。细菌素大多数都具有无污染、无毒副作用及无抗药性的特征[9]，在今后发展过程中有取代抗生素的趋势。细菌素一般对热、酸碱、紫外的作用不敏感，但对各种蛋白酶的作用比较敏感[10]。细菌素作为一种生物防腐剂，可以不同程度上抑制一些革兰氏阳性致病细菌及革兰氏阴性致病细菌的生长，代替化学防腐剂在食品中的使用，不仅可以大大降低对环境的污染，又能增加食品的安全性，从而获得安全可靠的食品[11-12]。虽然细菌素有较好的抑菌作用，但是微生物产细菌素的量非常少，投资成本较高，而且在实际的生产应用中效果也不稳定，极易受到其他环境和条件的影响，这些情况严重影响到细菌素的应用13-16]。

本试验是以植物乳杆菌为试用菌株，测定其所产的细菌素在不同温度、pH、蛋白酶以及紫外线4种不同因素的处理下对大肠杆菌的抑菌效果，为促进乳酸菌细菌素在不同领域、不同行业的研究与应用尤其是在食品中替代化学防腐剂应用方面提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌由中国计量大学生命科技学院食品系提供。

液体MRS培养基（1 L）：酵母浸粉5 g、葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、柠檬酸氢二铵2 g、硫酸镁0.58 g、胰蛋白胨10 g、磷酸氢二钾2 g、吐温80 1 mL、硫酸锰0.25 g、琼脂25 g、无水乙酸钠5 g、pH 6.2～6.6，121 ℃灭菌30 min。

固体MRS培养基（1 L）：在液体培养基的基础上加入25 g琼脂。

液体LB培养基（1 L）：胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母浸粉5 g、pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。

固体LB培养基（1 L）：在液体培养基的基础上再加18 g琼脂。

胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、蛋白酶K、碱性蛋白酶均产自上海亿欣生物科技有限公司。乙酸乙酯、乳酸、乙酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HeraguardTMECO超净工作台，美国Thermo Fisher公司；70F23N1P-M8（S0）型微波炉，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；HH-S4 型电子数显恒温水浴锅，江苏金怡科技有限公司；UV5型紫外可见分光光度计，瑞士Mettler Toledo 公司；YXO-LS-50G 型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；PHSJ-6L 型pH 计，上海仪电科学仪器有限公司；SorvaII ST1/ST4F PLUS 型离心机，美国Thermo Fisher 公司；902型超低温冰箱，美国Thermo Fisher公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵上清液的制备

取保藏在-80 ℃的冰箱中的植物乳杆菌菌种，平板划线于固体MRS培养基中，在37 ℃培养至出现明显单菌落。挑选合适大小的单菌落，37 ℃恒温条件下在液体MRS培养基中培养18 h，然后在50 mL MRS液体培养基中接种1%的培养液，置于37 ℃恒温条件下培养18 h后取出，在冷冻离心机中离心（参数为离心温度4 ℃，转速8000 r/min，离心时间15 min），离心完成后分离上清液过0.22 μm滤膜，置于4 ℃冰箱中保藏备用，将离心得到的沉淀弃去。

1.3.2 抑菌活性测定

指示菌菌液的制备[17]：以大肠杆菌作为指示的菌种，按1%的接种量接种到液体LB培养基中，在37 ℃恒温条件下过夜培养，备用。

产细菌素能力的测定参照董春嗜酸乳杆菌产细菌素能力的测定[18]。按照指示菌菌液的制备步骤得到大肠杆菌发酵液，吸取200 μL大肠杆菌的菌液涂布于LB平板上，烘干后打孔。吸取100 μL植物乳杆菌的发酵上清液加入孔内，37 ℃倒置培养8 h，测量抑菌圈直径的大小。

1.3.3 抑菌物质排除试验

过氧化氢排除试验：取2 mL 植物乳杆菌细菌素的发酵上清液，先用NaOH 溶液（1 mol/L）或HCl 溶液（1 mol/L）将植物乳杆菌发酵上清液pH值调至7.0，再加入10 mg过氧化氢酶，在37 ℃水浴中静置2 h后，再将pH调回5.0。通过牛津杯法测试其抑菌效果[19]。

有机酸排除试验：取2 mL 植物乳杆菌发酵上清液，用NaOH 溶液（1 mol/L）或HCl 溶液（1 mol/L）将植物乳杆菌发酵上清液pH值调至5.0。同时用乳酸、乙酸调节空白培养基（MRS培养基）至pH为5.0作为空白对照，通过牛津杯法测试其抑菌效果[19]。

1.3.4 细菌素粗提取

用乙酸乙酯对植物乳杆菌细菌素萃取后进行旋蒸，可得植物乳杆菌细菌素粗提液。具体步骤如下：将植物乳杆菌发酵上清液与乙酸乙酯按1∶1比例充分混合均匀，置于萃取瓶中静止萃取1 h，然后将上层溶液取出再加入相同体积的乙酸乙酯继续萃取1 h，将2次萃取的上层溶液混在一起置于薄膜蒸发器中进行旋转蒸发，温度为50 ℃，时间为15 min，用pH 6.8的PBS缓冲液溶液旋蒸产物（缓冲液与发酵液比例为1∶100）。

1.3.5 细菌素稳定性测定

热稳定性测定：取8等份已经制备好的植物乳杆菌细菌素粗提液置于10 mL离心管中，将离心管分别置于-80 ℃、-20 ℃、4 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100℃、121 ℃不同的温度下静置30 min，取出置于室温30 min后测定细菌素粗提液的抑菌活性，室温状态下未被处理的细菌素粗提液为对照，确定该植物乳杆菌细菌素的热稳定性。

pH值稳定性测定：采用NaOH和HCl溶液（浓度均为1 mol/L）分别调节细菌素粗提液pH为3、4、5、6、7、8，室温下静置24 h后再用NaOH 和HCl 溶液调回至细菌素粗提液的初始pH，测定不同pH处理下细菌素的抑菌活性，以未处理的细菌素粗提取物作为对照，抑菌活性测定采用牛津杯法测定，确定植物乳杆菌细菌素的pH 稳定性。

酶的稳定性测定：取6份2 mL的细菌素的粗提物，添加10 mg蛋白酶K、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，混匀，用NaOH和HCl溶液（浓度均为1 mol/L）将细菌素粗提液的pH分别调节至蛋白酶K、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的最适pH，在37 ℃水浴条件下处理1 h，取出置于室温下24 h，再将pH调回细菌素粗提液的初始值，测定不同蛋白酶处理下的抑菌活性，以不加蛋白酶处理的细菌素粗提取物作为对照[20]。

紫外稳定性测定：取等量的6 份细菌素粗提液分装于不同的试管中，于紫外光下分别照射0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，并以不用紫外光照射的粗提液为对照，以大肠杆菌为指示菌，进行抑菌试验。比较不同紫外条件处理下细菌素抑菌效果的变化情况，确定该细菌素的紫外稳定性[21]。

1.4 数据分析

每组实验做3次平行，数据分析采用SPSS 18.0软件进行，试验结果采用平均值±标准偏差表示，P＜0.05表示数据之间存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 抑菌物质排除

植物乳杆菌发酵过程除了产生细菌素外，还有可能产生有机酸、过氧化氢等其他物质抑菌物质。所以在确定抑菌物质时要排除有机酸和过氧化氢的干扰。通过试验得到表1结果。MRS培养基添加乳酸和乙酸后均没有出现抑菌圈，说明乳酸和乙酸没有抑菌作用，可以排除其影响；加入过氧化氢酶处理的植物乳杆菌发酵上清液抑菌圈直径小于植物乳杆菌发酵上清液，所以可以说明其主要抑菌作用的物质不是过氧化氢[22]，可排除过氧化氢的干扰。

表1 有机酸及过氧化氢作用的排除Table 1 Elimination of organic acids and hydrogen peroxide

2.2 植物乳杆菌细菌素稳定性

植物乳杆菌细菌素粗体液的热稳定性、pH 值稳定性、酶的稳定性测定、紫外稳定性测定的结果如图2所示。

细菌素粗提液在不同温度下处理后，以大肠杆菌被用作指示菌做抑菌测试，结果示于图1A中。结果显示：在经过-80 ℃处理后其抑菌效果比室温对照的抑菌效果好。在经过121℃处理30 min后，植物乳杆菌细菌素粗提液保留81%的抑菌效果，说明植物乳杆菌细菌素热稳定性较好。

图1 植物乳杆菌细菌素稳定性Figure 1 stability of lactobacillus plantarum bacteriocin

植物乳杆菌细菌素的原始pH为2.0。将粗提液经不同的pH处理后，结果如图1B所示，植物乳杆菌细菌素的抗菌活性逐渐随pH 值的增加而降低。当pH 为6.0 和7.0 时，该细菌素的抑菌圈直径分别为20 和19.5 mm，抑菌圈直径没有显著变化，说明在酸性和中性条件下，植物乳杆菌产生的细菌素稳定。在pH为8.0时仍保留69%的抑菌活性，说明该细菌素具有较为广泛的pH适用范围。

将粗提液经几种不同的蛋白酶处理后，抑菌效果结果如图1C所示。植物乳杆菌细菌素被6种蛋白酶处理过后，发现其抑菌活性均有不同程度的减小，证明其对蛋白酶有不同程度的敏感性。植物乳杆菌细菌素在经过胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及蛋白酶K的处理后，抑菌活性分别保留84%、98%、67%、91%、88%和98%，说明植物乳杆菌细菌素对蛋白酶K和碱性蛋白酶最不敏感，对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶较为敏感，对中性蛋白酶最为敏感。

将植物乳杆菌细菌素粗提液在不同的紫外照射时长处理后，抑菌结果如图1D所示。经过紫外线的照射，植物乳杆菌细菌素抑菌活性明显较小，且试验结果整体上呈现出随着紫外照射时间的升高抑菌活性逐渐降低的趋势。在经过紫外照射0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h 后，抑菌活性分别保留94%、92%、90%、87%、83%。在经过紫外照射2 h后，该细菌素依然保留83%的抑菌效果，说明植物乳杆菌细菌素紫外稳定性良好。

3 结论

本试验表明植物乳杆菌具有产细菌素能力，且其细菌素的稳定性较好。去除有机酸和过氧化氢的影响后，植物乳杆菌发酵液仍具有抗菌活性。将乙酸乙酯萃取法得到的植物乳杆菌细菌素粗提液进行抑菌性试验和生物学特性研究，证明植物乳杆菌细菌素不仅具有良好的抑菌效果，而且对温度的变化、pH的变化、紫外照射等条件不敏感，稳定性较强，但对部分蛋白酶敏感。植物乳杆菌细菌素在121 ℃高温处理30 min后仍存有81%的抑菌活性，具有优良的热稳定性；植物乳杆菌细菌素在pH 3.0～8.0 内均有优良的抑菌效果，在pH为8.0时仍保留69%的抑菌活性，有较为普遍的pH适用范围。该细菌素在经过胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及蛋白酶K 的处理后，抑菌活性分别保留84%、98%、67%、91%、88%和98%，说明该细菌素对蛋白酶较敏感。在经过紫外照射0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h后，抑菌活性分别保留94%、92%、90%、87%、83%。在经过紫外照射2 h后，该细菌素依然保留83%的抑菌效果，说明植物乳杆菌细菌素紫外稳定性良好。通过试验结果表明植物乳杆菌产生的细菌素可作为生物防腐剂在食品中应用。