过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

张 蒨,李 静

（锦州医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 锦州 121001）

胃癌是全球范围内常见的癌症之一，也是癌症死亡的主要原因之一，尽管近年来胃癌发病率呈缓慢下降趋势，但其并发症多，确切病因尚未完全阐明，严重威胁人类的健康，因此寻求分子靶点对胃癌诊断和治疗具有重要意义［1-2］。Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）是跨膜Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）家 族 成 员，TLRs作为信号转导蛋白，能识别通路相关的分子模式和内源性配体，TLR4激活可通过促进细胞凋亡抵抗、侵袭、转移和免疫监视逃避来促进肿瘤进展［3-5］。先天免疫是抵抗细菌入侵的第一道屏障，TLR4在先天性免疫和炎症中起着重要作用［6］。有研究［7-8］表明：TLRs基因与结肠癌和直肠癌的发展和预后相关。研究［9］显示：敲减Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）基因可以抑制结直肠癌细胞增殖。研究［10-11］显示：TLR4参与胃癌细胞增殖和迁移。过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬作用的相关研究报道较少，其机制尚未完全阐明。本研究采用慢病毒过表达RNA技术，在胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞中过表达TLR4基因，探讨其对胃癌细胞自噬能力的影响并阐明其可能的分子机制，为胃癌的诊断和治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人胃癌HGC-27细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），正常胃黏膜上皮GES-1细 胞 及 胃 癌MGC-803、BGC-823和SGC-7901细胞（美国模式培养物集存库）。RPMI 1640培养基（北京HyClone科技有限公司），DMEM高糖培养基和胰酶（美国Gibco公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），1%青-链霉素（武汉普诺赛生命科技有限公司），慢病毒及感染试剂（上海吉凯基因化学技术公司），CCK-8试剂盒（美国APExBIO公司），PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），TLR4和GAPDH抗体（美国Bioworld Technology公司），磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）、磷 酸 化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、蛋 白 激酶B（protein kinase B，Akt）和 磷 酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）（沈阳万类生物科技有限公司），哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）（美国Abcam公司），Beclin1和磷酸化mTOR（phosphory lated mTOR，p-mTOR）（美 国ABclonal公司），p62（美国Proteintech公司），微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）A/B（美 国Cell Signaling Technology公司），电化学发光剂（北京Biosharp公司）。倒置光学显微镜（日本Olympus公司），紫外可见光分光光度计（美国Thermo公司），基因扩增仪（德国费森尤斯公司），实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养和感染正常胃黏膜上皮GES-1细胞培养于含10%胎牛血清及1%青-链霉素的DMEM高糖培养基中，人胃癌HGC-27细胞培养于含20%胎牛血清及1%青-链霉素的RPMI 1640培养基中，人胃癌MGC-803、BGC-823和SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清及1%青-链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。将处于对数生长期的细胞计数铺板后37℃培养16～24 h，至细胞汇合度为20%～30%，更换培养基。SGC-7901细胞的最适感染复数（multiplicity of infection，MOI）为30时加入慢病毒和HitransG A感染增强液（吉凯基因自主研发的病毒感染增强液，其主要成分是一种新型的高分子非离子表面活性剂，同时也是一种细胞保护剂和促进吸收剂，可以通过提高细胞表面活性，增加病毒与细胞的接触面积，促进病毒高效感染细胞，且对细胞毒性极低，适合敏感细胞使用），BGC-823细胞MOI为30时加入慢病毒和HitransG P感染增强液（吉凯基因自主研发的病毒感染增强液，其主要成分是一种阳离子聚合物，通过抑制细胞膜与病毒之间的电荷排斥，增加慢病毒对细胞的感染效率），分为未感染组（普通培养基，无血清，无双抗）、阴性对照病毒组和过表达TLR4组。感染72 h，荧光表达丰度较高时，显微镜观察感染效率。感染效率达80%时，加入2 mg·L－1嘌呤霉素进一步筛选感染慢病毒的细胞，继续传代培养3～4代后进行后续实验。感染效率=感染细胞数/细胞总数×100%。

1.3 Western blotting法检测正常胃黏膜细胞和胃癌细胞及感染各组细胞中TLR4蛋白表达水平正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌SGC-7901、BGC-823、MGC-803和HGC-27细胞采用PBS缓冲液洗涤；慢病毒感染BGC-823和SGC-7901细胞后，将细胞由100 mm培养皿转移至1.5 mL离心管中，4℃、5 500 r·min－1离 心5 min，按 照RIPA∶PMSF（100∶1）配制裂解液，加入1%磷酸酶抑制剂，吹打混匀，超声碎细胞3次，每次10 s，每次有时间间隔，碎细胞前三蒸水擦洗，静置10 min，4℃、12 000 r·min－1离心25 min，弃上清。采用BCA蛋白定量法检测各组细胞蛋白浓度，制备浓度相同的蛋白样品。电泳后转膜1.5 h，将蛋白转移至PVDF膜上，室温下TBST配制1%BSA封闭液封闭2 h，一抗TLR4和GAPDH稀释比例为1∶10 000，4℃摇床孵育14～16 h；TBST洗膜3次，每次10 min；二抗稀释比例为1∶10 000，室温下摇床孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化学发光液按照A液∶B液=1∶1配制，均匀滴于膜上，使条带显影，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。独立实验重复3次。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.4 CCK-8法检测各组细胞增殖活性各组SGC-7901细胞按每孔5 000个、BGC-823细 胞 按每孔2 000个接种于96孔细胞培养板，每组设5个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；分别于细胞贴壁24、48、72、96和120 h后每孔加入10 μ L CCK-8溶液，孵育1 h，采用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度（A）值，独立实验重复3次，绘制生长曲线，细胞增殖活性以A值表示。

1.5 RT-qPCR法检测各组细胞中TLR4、Beclin1和LC3 mRNA表达水平采用TRIzol法提取总RNA，去旧培养基，100 mm培养皿中加入1 mol·L－1TRIzol溶液吹打混匀，转移至1.5 mL离心管中，室温下静置5 min；每个EP管加入200 μL氯仿，漩涡震荡混匀15 s，室温静置2～3 min；12 000 g、4℃离心15 min，吸上层无色水相400 μL至新的1.5 mL离心管；加入与上清液等体积的异丙醇400 μL，数次颠倒混匀，室温下沉淀10 min；12 000 g、4 °C离心10 min，可见白色羽毛状沉淀，去上清液，留沉淀；加1 mL无酶75%乙醇，漩涡或颠倒混匀，7 500 g、4℃离心5 min，去上清；室温下静置，至RNA略干后，加入20～100 μL DEPC水，－80 °C保 存。Nanodrop分 光 光 度 计 检测RNA浓度及纯度，1 μL无酶水校正，取A260/A280比值为1.8～2.0范围内样本。PCR引物序列：TLR4，F 5′-GCCGCTGGTGTATCTTTG-3′，R 5′-CATCCTGTACCCACTGTTCC-3′；GAPDH，F 5′-GTGAAGCAGGCGTCGGA-3′，R 5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′；LC3，F 5′-GACTTATTCGAGAGCAGCATCC-3′，R 5′-ACATGGTCAGGTACAAGGAACT-3′；Beclin 1，F 5′-CGTCCAACAACAGCACCAT-3′，R 5′-ACACGGTCCAGGATCTTGAA-3′。冰上配制各反应液，去除基因组DNA后，逆转录为cDNA，采用RTqPCR仪 扩 增。采 用2－ΔΔCt法 计 算 目 的 基 因mRNA表达水平，实验重复3次。

1.6 Western blotting法检测各组细胞中自噬相关蛋白和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平各组细胞蛋白质样品电泳后转移至PVDF膜上，LC3 0.22 μm膜、其余蛋白0.45 μm膜进行转膜1.5 h，LC3转膜30 min，室温下TBST配制1% BSA封闭液封闭2 h，根据maker对应的蛋白相对 分 子 质 量 裁 膜，LC3、Beclin1、p62、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt（一抗稀释比例1∶1 000）、mTOR（一 抗 稀 释 比 例1∶5 000）、p-mTOR（一抗稀释比例1∶2 000）和GAPDH（一抗稀释比 例1∶10 000）所 在 条 带4℃孵 育14～16 h；TBST洗膜3次，每次10 min，二抗稀释比例为1∶10 000，室温下摇床孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化学发光液按照A液∶B液=1∶1配制，均匀滴于膜上，使条带显影，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.7 统计学分析采用GraphPad Prism 8.3.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性，TLR4、Beclin1和LC3 mRNA表达水平，细胞中TLR4、p62、Beclin1、LC3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋 白 表 达 水 平 均符合正态分布，以xˉ±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞中慢病毒感染效率构建过表达TLR4慢病毒细胞株，荧光显微镜下观察结果显示：阴性对照病毒组和过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞慢病毒感染效率均大于80%，能够验证TLR4表达。见图1和2。

图1 倒置显微镜（A-C）和荧光显微镜（D-F）下观察慢病毒感染5 d后BGC-823细胞感染情况（Bar=200 μm）Fig.1 Infection of BGC-823 cells at 5 d after infection of lentivirus under inverted microscope(A-C)and fluorescence microscope(D-F)(Bar=200 μm)

2.2 各组细胞中TLR4蛋白表达水平Western blotting法检测结果显示：胃黏膜上皮GES-1细胞和 胃 癌SGC-7901、BGC-823、MGC-803及HGC-27细胞中TLR4蛋白表达水平分别为1.00±0.00、0.63±0.08、3.01±0.61、2.02±0.62和1.84±0.29；与胃黏膜上皮GES-1细胞比较，胃癌BGC-823、MGC-803和HGC-27细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），胃癌SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。未感染组、阴性对照病毒组和过表达TLR4组BGC-823细胞中TLR4蛋白表达水平分别为1.00±0.00、1.37±0.51和40.81±19.06；SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平分别为1.00±0.00、1.49±0.61和6.98±3.04；与未感染组和阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见图3和4。

图3 Western blotting法检测GES-1细胞和胃癌细胞中TLR4蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of TLR4 protein in GES-1 cells and gastric cancer cells detected by Western blotting method

2.3 各组细胞增殖活性CCK-8法检测结果显示：在感染96和120 h时，与未感染组和阴性对照病毒组比 较，过 表 达TLR4组BGC-823细 胞 和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表1和2。

表1 CCK-8法检测各组BGC-823细胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of BGC-823 cells in various groups detected by CCK-8 assay (n=3，±s）

表1 CCK-8法检测各组BGC-823细胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of BGC-823 cells in various groups detected by CCK-8 assay (n=3，±s）

*P＜0.05 compared with non-infection group；△P＜0.05 compared with negative control virus group.

Group Non-infection Negative control virus Over-expreession TLR4 Proliferation activity of BGC-823 cells(t/h)24 0.32±0.08 0.31±0.09 0.37±0.08 48 0.35±0.10 0.33±0.08 0.47±0.11 72 0.36±0.04 0.39±0.05 0.70±0.09 96 0.44±0.08 0.48±0.07 0.87±0.14*△120 0.57±0.09 0.63±0.07 1.13±0.18*△

2.4 各组细胞中TLR4、LC3和Beclin1 mRNA表达水平与阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细 胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P＜0.01），Beclin1 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），SGC-7901细胞中LC3 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。见图5。

图5 RT-qPCR法检测各组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4、LC3和Beclin1 mRNA表达水平Fig.5 Expression levels of TLR4,LC3 and Beclin1 in BGC-823 and SGC-7901 cells in various groups detected by RT-qPCR method

2.5 各组细胞中自噬相关蛋白和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平与未感染组和阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见图6和7。

图4 Western blotting法检测各组BGC-823细胞（A）和SGC-7901细 胞(B)中TLR4蛋 白 表 达 电 泳 图Fig.4 Electrophoregram of expressions of TLR4 protein in BGC-823 cells(A)and SGC-7901 cells(B)in various groups detected by Western blotting method

图6 各组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中自噬相关蛋白表达电泳图(A,B)和直条图（C,D）Fig.6 Electrophoregram(A,B)and histogram(C,D)of autophagy-related proteins in BGC-823 cells and SGC-7901 cells in various groups

表2 CCK-8法检测各组SGC-7901细胞增殖活性Tab.2 Proliferation activities of SGC-7901 cells in various groups detected by CCK-8 assay (n=3，±s）

表2 CCK-8法检测各组SGC-7901细胞增殖活性Tab.2 Proliferation activities of SGC-7901 cells in various groups detected by CCK-8 assay (n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with non-infection group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with negative control virus group.

Group Non-infection Negative control virus Over-expreession TLR4 Proliferation activity of SGC-7901 cells(t/h)24 0.38±0.08 0.37±0.07 0.45±0.10 48 0.50±0.07 0.49±0.08 0.67±0.17 72 0.61±0.09 0.60±0.09 0.86±0.30 96 0.71±0.10 0.73±0.09 1.17±0.21*△120 0.80±0.04 0.79±0.04 1.33±0.15**△△

3 讨 论

研究［12-13］显示：TLR4在胃癌组织和细胞中表达上调，在正常胃黏膜中低表达。本研究选择正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌SGC-7901、BGC-823、MGC-803和HGC-27细胞作为研究对象，证实TLR4基因在胃癌细胞中高表达。采用慢病毒过表达TLR4基因的BGC-823细胞和SGC-7901细胞，感染96和120 h时与未感染组比较，阴性对照病毒组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性差异无统计学意义，而过表达TLR4组细胞增殖活性明显升高，证实过表达TLR4基因能增强胃癌细胞的增殖能力。

细胞凋亡也被称为Ⅰ型程序性细胞死亡，自噬则被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。细胞自噬是指细胞在外界环境因素的影响下，细胞利用溶酶体降解自身受损、变性或衰老的大分子物质和细胞器的自我消化过程［14］。生存信号刺激包括PI3K、Akt和mTOR信号途径，能够抑制自噬；当生存信号不足时，PI3K信号途径减弱，同时还伴随自噬或凋亡减少［15］。微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubuleassociated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）是自噬体的标准标记物，通过细胞溶质微管相关蛋白1轻 链3-Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ，LC3-Ⅰ）与新生自噬体表面的磷脂酰乙 醇 胺（phosphatidylethanolamine，PE）结 合 产生；p62是一种泛素结合蛋白和多功能衔接蛋白，具有调节细胞事件的多种功能；Beclin1是酵母Atg6的哺乳动物直系同源体，也是自噬机制的核心成分，通过激活Vps34在自噬调节中起着核心作用［16-18］。研究［19-20］显示：TLR4基因能抑制细胞自噬，并损害小胶质细胞的吞噬能力。TLR4能激活细胞自噬，从而促进肺癌细胞的迁移和侵袭，也能参与激活自噬途径并改变结直肠癌的化疗反应［21-22］。本研究结果显示：与未感染组和阴性对照病毒组比较，过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-790细胞中p62蛋白表达水平明显升高，LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低，p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高，提示过表达TLR4基因可能通过调控PI3K/Akt/mTOR细胞信号通路及自噬相关蛋白LC3、Beclin1和p62的表达明显抑制胃癌细胞的自噬。

图7 各组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达电泳图(A,B)和直条图（C,D）Fig.7 Electrophoregram(A,B)and histogram(C,D)of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in BGC-823 cells and SGC-7901 cells in various groups

综上所述，TLR4基因在胃癌细胞上高表达，过表达TLR4基因可以促进胃癌细胞增殖，通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路及自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p62的表达，明显抑制胃癌细胞自噬。本研究证实TLR4基因在胃癌中起着关键作用，提示其可能为胃癌治疗提供新的治疗靶点。