忧遁草叶茎中活性组分分析及其饮料制备工艺

冯立婷 ， 王 聪

（1. 大连工业大学仪器分析中心，辽宁 大连 116034；2. 哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090）

0 引言

忧遁草，别名鳄嘴花，为爵床科鳄嘴花属草本植物[1]；茎圆柱状，具条纹，无毛；叶先端锐尖或渐尖，边缘呈齿状[2]，是一种生长在靠近赤道的低海拔疏林中或灌丛内潮湿砂质土壤里的野生灌木状草本植物，多分布于马来西亚、印度尼西亚、泰国等东南亚国家及我国南部至西南部如广东、海南、云南等地区[3]。

近年来，研究者对忧遁草展开了一系列研究，整体上看仍然属于刚刚起步阶段。研究表明，忧遁草中含有三萜类、黄酮碳苷、植物甾醇、含硫糖苷类等生物活性成分以及丰富的必需氨基酸和微量元素[2-3]，具有较高的药用价值和食用价值[4-5]。不同种类的忧遁草提取物及其纯化物具有抗氧化、抗炎症、抗病毒、抗糖尿病、抗肿瘤等生物活性[6-7]。

民间用新鲜的忧遁草叶片榨汁饮用，或将其作为蔬菜食用，不利于运输和贮存，且目前关于其食品开发也鲜有报道[8]。国内市场仅有忧遁草茶叶和忧遁草粉两种忧遁草产品。采用不同的有机溶剂萃取忧遁草茎叶中的活性成分，并对其进行定量研究；在该研究基础上进行忧遁草茶饮料的开发，探索其浸提工艺及其配方设计，最终产品不仅保留了忧遁草原料原有特色，营养丰富、风味独特纯正，而且便于携带和保存，为忧遁草食品的进一步开发提供理论依据和工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料

忧遁草原料来自云南，将植物清洗分离后于日光下自然风干，茎叶分离，并分别用高速中药粉碎机将茎、叶粉碎至粉末状，用60 目筛筛分后备用。无水乙醇、正丁醇、氯仿、甲醇等，天津市科密欧化学试剂有限公司提供，均为分析纯；木瓜蛋白酶、果胶酶，Amresco 公司提供；牛血清白蛋白，Roche公司提供；齐墩果酸、芦丁、豆甾醇、谷甾醇为标准品（纯度≥90%），乙腈、乙酸为色谱纯，Fluka 公司提供。

1.2 组分提取

分别将忧遁草叶粉与各浸提溶剂按1∶25 的比例恒温磁力搅拌3 h，减压过滤得滤液，滤液经旋蒸浓缩后冷冻干燥得到5 种提取物，即忧遁草粉水提物、甲醇提取物、乙醇提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物的粉末[9]。

1.3 活性成分测定方法

根据不同的发色原理，采用比色法测定总萜类物质的含量[10]，总黄酮含量[11]及叶绿素含量[12]。反相高效液相色谱法（RP-HPLC） 测定甾醇类物质的含量[13]。BCA 法[14]测定可溶性蛋白质含量。

1.4 忧遁草水提体系稳定性影响因素研究

1.4.1 忧遁草饮料的制作工艺

采用如下流程进行饮料的制作：

忧遁草烘干全叶→筛选→粉碎→浸提（酌情加入β - 环糊精） →抽滤→离心→酶解→离心过滤→调配→灌装杀菌→冷却→成品→包装。

1.4.2 料液浸提条件对体系稳定性的影响

料液浸提条件（浸提温度、浸提时间、茶水质量比） 是决定忧遁草茶汤品质的重要因素，浸提工艺的好坏直接影响后续茶饮料产品加工品质（见表1）。根据浸提后茶汤稳定性的变化，确定最佳浸提条件。请10 名有一定品评经验的感官评审员对浸提后的茶汤进行感官评分，满分为100 分，其中汤色25 分，香气35 分，滋味40 分，结果取其平均值。

茶汤浸提因素与水平设计见表1，茶汤感官评分标准[15]见表 2。

表1 茶汤浸提因素与水平设计

表2 茶汤感官评分标准

1.4.3 木瓜蛋白酶对体系稳定性的影响

取部分茶汤，用去离子水稀释5 倍，再用柠檬酸溶液调节至其酶最适pH 值6.0，取等量适量茶汤分装在玻璃容器中，分别加入茶汤体积0，0.01%，0.02%，0.04%的木瓜蛋白酶并混合均匀，置于60 ℃电热恒温水浴锅中，依次在0，30，60，120 min 时取样，于90 ℃条件下保温10 min 使酶灭活，然后以转速8 000 r/min 离心15 min，取上清液用BCA 法测定蛋白质浓度，并作出溶液中蛋白质浓度随时间变化曲线。

1.4.4 果胶酶对茶汤稳定性的影响

取茶汤浸提液稀释5 倍，用柠檬酸调节至其水解最适pH 值3.0，取等量适量茶汤分装于玻璃容器中，分别加入0，0.02%，0.04%，0.08%的果胶酶搅拌均匀，于50 ℃条件下水解，在水解时间为1，2 h时分别取样，用果胶物质定性检测方法测定茶汤中果胶物质含量。果胶物质定性采用酒精法[16]。

将95%的乙醇与澄清酶解液等体积混合于50 mL试旋紧管口并翻转轻摇，静置15 min 后观察。如果未出现凝胶状物质，说明酶解液中的果胶物质被分解完全，体系中已无果胶物质存在，用符号“-”表示；如果出现凝胶状物质，表明酶解液中的果胶物质没有被分解完全，用符号“+”表示。酶解液中凝胶状物质越多，其“+”个数也越多。

1.4.5 pH 值对茶汤稳定性的影响

pH 值是影响茶汤色泽及茶汤稳定性的一个主要因素，同时影响饮用口感[17]。用食用级柠檬酸及碳酸氢钠调整茶汤pH 值，经灌装杀菌（121 ℃，15 min）后观察并记录结果。

1.4.6 其他影响因素

分别在茶汤中加入0，0.01%，0.02%，0.05%的维C，灌装灭菌后避光保存，观察其护色效果；在浸提时分别加入0，0.1%，0.2%，0.4%的β - 环糊精（β-CD），观察其护色及对苦味的包埋效果；分别向茶汤中加入0，0.01%，0.02%，0.05%的六偏磷酸钠，灌装杀菌（121 ℃，15 min） 后观察其沉淀产生情况。

2 结果与分析

2.1 忧遁草原料中活性组分的含量确定

2.1.1 萜类物质的测定

三萜含量标准曲线见图1。

图1 三萜含量标准曲线

由图1 可知，标准曲线公式为：Y=0.008 08X-0.012 11，R2=0.997 49。通过测定忧遁草不同处理样品的吸光度值计算不同溶剂提取的忧遁草叶粉末、忧遁草叶粉末浸提浓缩物及忧遁草茎粉末中三萜含量。

忧遁草不同部位三萜含量见图2。

图2 忧遁草不同部位三萜含量

2.1.2 黄酮类物质的测定

黄酮含量标准曲线见图3。

图3 黄酮含量标准曲线

由图3 可知，标准曲线公式为：Y=42.947X-0.006 99，R2=0.999 3。通过测定忧遁草不同处理样品的黄酮吸光度，计算不同溶剂提取的忧遁草叶粉末、忧遁草叶粉末浸提浓缩物及忧遁草茎粉末中黄酮含量。

忧遁草不同部位黄酮含量见图4。

图4 忧遁草不同部位黄酮含量

2.1.3 叶绿素的测定

计算不同溶剂提取的忧遁草叶粉末、忧遁草叶粉末浸提浓缩物及忧遁草茎粉末中叶绿素含量，换算成每千克样品含有的毫克数（mg/kg） 表示。

忧遁草不同部位及浸提条件下叶绿素含量见图5。

图5 忧遁草不同部位及浸提条件下叶绿素含量

2.1.4 甾醇类物质的测定

以吸光度（A） 为纵坐标，以甾醇含量（mg） 为横坐标，绘制标准曲线。

标准品出峰时间（豆甾醇：10.468 s，谷甾醇：11.888 s） 见图 6。

图6 标准品出峰时间（豆甾醇：10.468 s，谷甾醇：11.888 s）

由图6 可知，豆甾醇曲线为Y1=3 045X+4.383 5，R2=0.999 7；谷甾醇曲线为 Y2=24 715X+2.843 5，R2=0.999 7；将得到的豆甾醇和谷甾醇含量相加，即为样品中甾醇类物质总含量。

计算出样品中的含量X，进而得出不同溶剂提取的忧遁草叶粉末、忧遁草叶粉末浸提浓缩物以及忧遁草茎粉末中甾醇类物质含量X（g/100 g）。

忧遁草不同部位及浸提条件下甾醇含量见图7。

图7 忧遁草不同部位及浸提条件下甾醇含量

2.2 溶剂种类对活性组分提取率的影响研究

对7 种不同处理手段样品的4 种活性成分进行定量分析，将结果都转化为测得的活性成分在忧遁草茎/叶直接粉碎物中的百分含量，采用蛛网图[18-19]的形式的表达试验结果。

忧遁草不同部位及浸提条件下各活性成分含量见图8。

图8 忧遁草不同部位及浸提条件下各活性成分含量

由图8 可知，对于同种活性成分（同种颜色），以在得到的相对活性成分含量最大值（最外围数值）即为忧遁草叶/茎直接粉碎粉末中实际活性成分质量分数。研究发现，对忧遁草叶粉末和忧遁草粉末浸提浓缩物而言，叶绿素在氯仿中的溶解度最大，为171.7 mg/kg，总黄酮在忧遁草叶粉末中含量最高，为2.13%，三萜类物质含量在叶粉末中含量最大，为1.17%，总甾醇在氯仿提物中的含量最大，为1.72%。对忧遁草茎粉碎物而言，其叶绿素含量为47.98 mg/kg，含量微乎其微；总黄酮含量为0.44%，约是叶粉末含量的五分之一；三萜含量为1.13%，与叶粉末相当；甾醇含量未达到检出限，未被检测到。

总体而言，忧遁草叶中活性成分含量要高于茎，说明叶更具食用价值和营养价值。同时，对于表格后5 列不同溶剂忧遁草叶粉末浸提物而言，水提物中三萜含量较高，乙醇提取物中黄酮及三萜含量较高，氯仿提物中叶绿素、三萜、甾醇含量较为突出，正丁醇提物三萜含量较高，而甲醇提取物中黄酮含量较高。对于不同极性的溶剂，不同活性成分在其中的最大溶解度不同。

2.3 忧遁草浸提条件的优化

料液浸提条件（浸提温度、浸提时间、茶水质量比） 是决定忧遁草茶汤品质的重要因素，浸提工艺的好坏直接影响后续茶饮料产品加工品质。根据三因素三水平试验及茶汤感官评价标准，得到感官评价正交结果。

茶汤感官评价正交结果见表3。

表3 茶汤感官评价正交结果

根据极差大小得出茶汤感官审评影响因素由大到小排序为浸提温度、茶水质量比、浸提时间。A3B2C1（8 号试验） 组别在综合得分以及均值分布上得分皆最高，因此判定此组别为最佳组合，即浸提温度为85 ℃，浸提时间为40 min，茶水质量比为1∶25 时茶汤的感官品质最好。

2.4 忧遁草水溶性提取物稳定控制技术

为提高溶液澄清效果，选择木瓜蛋白酶和果胶酶，在酶最适条件下对用最佳浸提工艺浸提的茶汤进行酶解。研究发现，占茶汤体积0，0.01%，0.02%，0.04%的木瓜蛋白酶水解后，忧遁草浸提液中蛋白质质量浓度分别为 952，744.7，692.7，313 μg/mL。当加酶量为0.04%时忧遁草浸提液中可溶性含量最少，因此确定该木瓜蛋白酶浓度为酶解浓度。茶饮料中茶多酚及其氧化物与茶汁中的蛋白质、咖啡碱、金属离子、果胶等发生络合，主要是分子间的氢键、盐键、疏水作用、电解质、电场、溶解性等的变化，使溶液由澄清变为浑浊状态[20]。此时析出的沉淀称为“茶乳”，会影响茶饮料的感官品质及质量。

用不同浓度的果胶酶作用于茶汤浸提液，对果胶含量进行测定。结果表明，未加入果胶酶的样品含有较多果胶，当果胶酶质量浓度达到0.04 g/100 mL，水浴时间为2 h 时，茶汤中果胶物质被完全分解；随着酶质量浓度达到0.08 g/100 mL，水浴1 h，茶汤中果胶物质被分解完全。从经济成本和茶汤品质2 个方面综合考虑，最终确定果胶酶质量浓度为0.04 g/100 mL，水浴时间2 h，可将茶汤中大分子果胶分解为小分子可溶性物质，从而提高茶汤稳定性。

茶汤汤色及澄清度随pH 值变化见表4。

表4 茶汤汤色及澄清度随pH 值变化

若将上述表格更加形象化地表示，可以按照打分制的原则，上表中标有“*”的项记为5 分满分，其余项感官评价效果越差分数越低，最低分为1 分。在每个pH 值条件下3 项累计加和，转化成堆积条形图的形式，得分即为最终感官评价结果。

茶汤pH 值与感官评价总得分见图9。

图9 茶汤pH 值与感官评价总得分

结果表明，降低茶汤的pH 值可以有效防止茶汤变色，同时有利于提高茶汤的澄清稳定性及改善茶感。当pH 值降为5.0 时，茶汤为橙黄色，溶液澄清透明，涩味较淡，得分最高，品质最佳。因此，选择pH 值5.0 作为最佳护色手段。

2.4.1 维C 对体系稳定性的影响

维C 作为一种食品级常用抗氧化剂，对茶汤有明显的护色作用，而且不会影响茶饮料的风味，作用机理为可与茶饮料中的溶氧反应生成氧化型维C，从而避免溶氧与茶汤中的单宁等成分反应而色泽变褐[21]。

维C 添加量对汤色稳定性的影响见表5。

表5 维C 添加量对汤色稳定性的影响

由表5 可知，较之未添加维C 的茶汤，添加维C茶汤的色泽均有一定的改善，且添加量为0.05%的组别在第15 天依然保持良好的色泽，因此确定维C最适添加量为0.05%。另外，维C 也是一种营养物质，添加可以起到补充营养元素的作用。

2.4.2 β - 环糊精对体系稳定性的影响

加入β - 环糊精可以包合茶汤中的叶绿素，防止儿茶素的氧化褐变，对茶汤色泽有保护作用。在茶饮料加工中，通过添加β - 环糊精，对茶汤中的挥发性物质进行包埋，可降低茶汤的苦涩味，减少其对味觉神经的刺激；同时减少香气物质的挥发和损失，从而达到保香护色的目的[22]。

β - 环糊精添加量对茶汤感官品质的影响见表6。

表6 β - 环糊精添加量对茶汤感官品质的影响

通过对加入不同浓度β-CD 浸提的茶汤进行品鉴，可以看出当β-CD 添加量为0.2%时茶汤口感、汤色较好，适合饮用，因此选用此浓度下的β-CD 作为浸提辅助添加剂，可有效改善茶汤口感。

2.4.3 离子螯合剂对体系稳定性的影响

六偏磷酸钠为一种常用离子螯合剂，能与茶汤中多价金属离子和碱土金属离子络合，从而形成可溶性金属络合物，有利于减少茶乳的生成[23]。研究表明，随着六偏磷酸钠加入量的提高，沉淀量逐渐减少，当添加量达到0.05%时几乎无沉淀产生，防沉淀效果最好。

3 结论

忧遁草叶绿素在氯仿中的溶解度最大，为0.0171 7%；总黄酮在忧遁草叶粉末中含量最高，为2.13%；三萜类物质含量在叶粉末中含量最大，为1.17%；同样，总甾醇在叶粉末中的含量也最大，为8.09%；忧遁草茎中黄酮及甾醇含量较高。忧遁草饮料最佳制作工艺为浸提时加入0.2 g/100 mL β - 环糊精，料液比1∶25，浸提温度80 ℃，浸提时间40 min后抽滤离心（8 000 r/min，15 min） 得茶汤；然后可将所得茶汤分别用0.02%木瓜蛋白酶及0.04%果胶酶水解，优化后的配方为25%忧遁草浸提液，0.05%维C，0.05%六偏磷酸钠，6%白砂糖，0.1%柠檬香精，最后调节溶液pH 值5.0，进行调配灌装，并在高压灭菌锅中进行灭菌（121 ℃，15 min）。该研究的结果可为忧遁草产品开发提供一定的理论和技术支撑。