抑菌剂对红枣中黑曲霉和黄曲霉的抑制作用

胡 蝶，董 腾，薛雅文，寇晓萌，郭佳琳，王 静，姬 华

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

红枣营养丰富、香甜可口、皮薄肉多，有“树上粮食”之称[1]，具有非常高的经济价值和药用价值[2]。但红枣成熟比较集中，由于含有大量的水分和丰富的营养物质，极易感染病菌而发生霉变、腐烂降低品质，造成较大的资源浪费、环境污染和经济损失[3]。黑曲霉和黄曲霉是引起红枣腐败变质的主要致病霉菌, 对红枣品质及可食用性造成极大的危害。因此，筛选安全、有效的防治措施来控制红枣采后腐烂病的发生具有重大的意义。主要研究乳酸链球菌素、单宁、壳聚糖、山梨酸钾、纳他霉素、薄荷精油、百里香精油对分离自红枣的黄曲霉和黑曲霉的抑菌作用。通过抑菌试验，分析抑制剂对黑曲霉和黄曲霉的抑菌特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉 （Aspergillus flavus） 和黑曲霉 （Aspergillus niger） 各1 株，为前期从腐败红枣中分离、筛选并鉴定后保存的菌株，保存于-80 ℃冰箱中；乳酸链球菌素，洛阳奇泓科技有限公司提供；山梨酸钾，杭州保圣配料有限公司提供；纳他霉素、单宁、壳聚糖、薄荷精油、百里香精油，上海麦克林生化科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

ZXSD-1160 型全自动生化培养箱，上海智诚仪器有限公司产品；LDZX-30KBS 型立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；IX71 型倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯公司产品；DK-8D 型恒温水浴锅，江苏金坛仪器有限公司产品；995 型超低温冰箱，美国赛默飞世尔公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 孢子液的制备

采用Wang L 等人[4]的方法将黑曲霉和黄曲霉活化后在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） 培养基上于25 ℃条件下培养7 d，加入0.05%吐温80 的无菌水，并在培养基表面轻轻搅动，过滤后制成孢子液，用血球计数板计数，孢子浓度调整到106个/ mL，现配现用。

1.3.2 牛津杯法

取100 μL 孢子悬浮液，在已灭菌的PDA 培养基上均匀涂布后，放置牛津杯。将乳酸链球菌素、单宁、壳聚糖、山梨酸钾、纳他霉素、薄荷精油和百里香精油分别配成1 000 mg/L 和1 000 μL/L 的溶液，溶剂为无水乙醇。取200 μL 配好的溶液加入每个牛津杯中[5]，于28 ℃下培养72 h，测量抑菌圈的直径，重复3 次。

1.3.3 最小抑菌浓度的测定

采用琼脂稀释法[6]，用无水乙醇将每种抑菌剂稀释，分别吸取不同量稀释液加入到已灭菌的冷却至50 ℃的19 mL PDA 培养基中，制备成带有不同浓度抑菌剂的培养基，乳酸链球菌素的终质量浓度为10，50，100，500，1 000 mg/L，薄荷精油和百里香精油的终体积浓度为10，50，100，500，1 000 μL/L，山梨酸钾、壳聚糖和单宁的终质量浓度为1 000，2 000，4 000，8 000，10 000 mg/L，纳他霉素的终质量浓度为3，4，5，6，7 mg/L，对照组为培养基和无水乙醇，及培养基和抑菌剂。取孢子悬浮液100 μL于平板表面，涂布均匀后，保鲜膜密封，于28 ℃下培养观察48 h，以完全没有菌生长的最小浓度作为该抑菌剂的最小抑菌质量浓度（MIC）。每个处理重复3 次。

1.3.4 菌丝生长直径的测定

在PDA 培养基中分别加入不同量的抑菌剂，使纳他霉素的质量浓度分别为1，2，3，4，5 mg/L。然后，将100 μL 黑曲霉和黄曲霉的孢子悬浮液接种于PDA 培养基中心，以溶剂为对照。于28 ℃下培养，用十字交叉法测量菌落直径，每12 h 测1 次，设 3 个平行试验[7]。

1.3.5 孢子萌发抑制率的测定

在马铃薯葡萄糖水培养基中分别加入不同量的抑菌剂，使纳他霉素的质量浓度分别为1，2，3，4，5，6 mg/L。然后将100 μL 黑曲霉和黄曲霉的孢子悬浮液接种于试管中，于28 ℃下培养观察，以溶剂为对照。直到对照的萌发率达到95%以上，每个试管随机观察100 个孢子，统计孢子萌发数，以芽管长度超过孢子最大直径的一半作为萌发标准，按公式计算萌发抑制率[8]。

1.3.6 菌丝形态的观察

在PDA 培养基中加入不同量的抑菌剂，使纳他霉素质量浓度为1 MIC（6 mg/L） 和2 MIC（12 mg/L），接入100 μL 黄曲霉和黑曲霉的孢子液，并设置空白对照组。取灭菌载玻片，斜插于培养基内。于28 ℃下培养7 d，取出用倒置显微镜观察。

1.3.7 红枣果实的影响

挑选无损伤、大小颜色一致的新鲜红枣，随机分成3 组，每组5 个果实。在其表面喷洒75%的酒精进行消毒杀菌。然后用无菌水冲洗后，晾干。用灭过菌的打孔器在红枣的中部打孔，直径为3 cm，深度为3 cm。接种100 μL 孢子悬浮液，其中一组喷洒6 mg/L（MIC） 的纳他霉素，另一组喷洒5 mg/L（MIC） 的乳酸链球菌素。接种后置于塑料盒中，用无菌袋密封，于28 ℃下培养7 d，统计红枣果实的发病率。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2019 进行统计分析，得到的结果表示为平均值±标准误差，利用Origin 2019进行制图。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈大小

抑菌剂对黑曲霉和黄曲霉的抑菌效果见表1。

表1 抑菌剂对黑曲霉和黄曲霉的抑菌效果/mm

由表1 可知，乳酸链球菌素和纳他霉素对红枣中黑曲霉和黄曲霉具有明显的抑菌特性，单宁、壳聚糖、山梨酸钾对黑曲霉和黄曲霉无明显抑菌特性，薄荷精油和百里香精油有一定的抑菌性。抑菌圈的直径越大，说明其抑菌效果越好。纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉的抑菌圈直径均大于20 mm，表现出高敏感性，乳酸链球菌素对黑曲霉的抑菌作用优于黄曲霉。

2.2 最小抑菌质量浓度

抑菌剂对黑曲霉和黄曲霉的最小抑菌浓度见表2。

表2 抑菌剂对黑曲霉和黄曲霉的最小抑菌浓度

由表2 可知，最小抑菌浓度为山梨酸钾＞乳酸链球菌素＞纳他霉素，纳他霉素的抑菌效果表现最好。乳酸链球菌素对黑曲霉和黄曲霉的最小抑菌质量浓度分别为1 000 mg/L 和500 mg/L，纳他霉素对黑曲霉和黄曲霉的最小抑菌质量浓度分别为5 mg/L和6 mg/L，山梨酸钾对黑曲霉和黄曲霉的最小抑菌质量浓度均为8 000 mg/L，薄荷精油和百里香精油对黑曲霉和黄曲霉的最小抑菌体积浓度同为1 000 μL/L。单宁和壳聚糖在10 000 mg/L 时仍有菌落生长，未测出最小抑菌质量浓度。

百里香精油[9]对火龙果中的致病菌层生镰刀菌和平头炭疽菌的最小抑菌体积浓度为1 000 μL/L，表现出较强的抑菌性。百里香精油和薄荷精油[10]对猕猴桃中致病菌尖孢炭疽菌和葡萄座腔菌的最小抑菌体积浓度分别为5 000 μL/L 和25 000 μL/L，薄荷精油对葡萄座腔菌有一定的抑菌性，但抑菌浓度相比其他精油较高。500 μL/L 的薄荷精油[11]对链格孢霉菌丝生长和孢子萌发都有较高的抑制作用。纳他霉素[5]对柑橘中意大利青霉和指状青霉都有极强的抑制性，浓度越高，抑菌作用越明显，两者的最小抑菌质量浓度均为6 mg/L。

2.3 纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉菌丝生长的抑制作用

不同质量浓度纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉菌丝的抑制作用见图1。

由图1 可知，随着纳他霉素质量浓度越来越大，对红枣中黑曲霉和黄曲霉菌丝生长的抑制作用逐渐增强。且随着时间的增加，仍对黑曲霉和黄曲霉菌丝生长有明显的抑制效果。低浓度的纳他霉素对黑曲霉的抑菌效果优于黄曲霉。当纳他霉素质量浓度为5 mg/L时，黑曲霉在第2 天没有生长。培养7 d 后，菌丝快速生长，黑曲霉和黄曲霉基本都达到最大直径。

图1 不同质量浓度纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉菌丝的抑制作用

2.4 纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉孢子萌发的抑制作用

纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉孢子萌发抑制率见图2。

由图2 可知，随着纳他霉素质量浓度的增高，黄曲霉孢子萌发受到明显抑制，在纳他霉素质量浓度6 mg/L 时，黄曲霉和黑曲霉的孢子萌发抑制率均大于90%，且对黑曲霉的抑制效果优于黄曲霉。孢子是真菌存在和传播的重要结构，纳他霉素可以显著抑制黑曲霉和黄曲霉的孢子萌发，从而抑制其生长繁殖。

图2 纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉孢子萌发抑制率

2.5 纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉菌丝形态的影响

纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉菌丝的影响见图3。

图3 纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉菌丝的影响

抑菌活性物质在霉菌的生长过程中，能够改变菌丝形态，并且造成菌丝畸形，严重可以导致菌丝断裂，从而阻碍菌丝的正常生长。由图3 可知，纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉菌丝生长形态存在严重的影响，对照组菌丝光滑顺直，结构完整，形态规则，隔膜明显（图3 A，D）。而经过6 mg/L 和12 mg/L纳他霉素处理的菌丝发生了多种形态变化，菌丝表面粗糙，部分出现皱缩变形，并且出现膨大凸起（图3 B，E）。相比之下，12 mg/L 处理组的菌丝形态变化更为剧烈，菌丝表面出现严重褶皱，膨大凸起，整体扭曲变形严重，从而使细胞内容物质泄漏（图3 C，F）。可看出，纳他霉素处理对黄曲霉和黑曲霉菌丝有损伤作用。

2.6 纳他霉素和乳酸链球菌素在红枣中的应用

纳他霉素和乳酸链球菌素对红枣的抑菌作用见图4。

图4 纳他霉素和乳酸链球菌素对红枣的抑菌作用

红枣未喷洒药剂，有3 个生霉，发病率为60%，经过纳他霉素和乳酸链球菌素的喷洒，霉菌未能在红枣上生长，且不影响红枣的品质。因此，可以将纳他霉素和乳酸链球菌素应用于红枣采后保鲜中。

3 结论

试验通过筛选抑制剂，研究不同抑菌剂对红枣中黑曲霉和黄曲霉的抑菌特性。纳他霉素对抑制黄曲霉和黑曲霉菌丝生长和孢子萌发都有明显效果。研究发现，纳他霉素对黄曲霉和黑曲霉抑菌效果最好，其次是乳酸链球菌素，试验还表明薄荷精油和百里香精油对黑曲霉和黄曲霉有一定抑制效果，山梨酸钾的抑菌性较差。

目前，国内在黑曲霉和黄曲霉抑菌剂的研究中，对黑曲霉和黄曲霉都有抑菌效果的还有丁香精油[12]、乳酸菌素[13]，对黑曲霉有抑菌效果的还有燕麦中β -葡聚糖、多酚及黄酮[14]、短波紫外线[15]、气态植物精油，对黄曲霉有抑菌效果的还有八角茴香[12]、猪毛蒿精油及其活性成分萜品- 4 - 醇。一氧化氮熏蒸可抑制灰枣的黑曲霉病，结果表明一氧化氮可显著抑制黑曲霉的生长，延缓了灰枣果实含水率、可溶性固形物、还原糖、可滴定酸和维C 含量的下降，保持果实品质。国外对红枣抑菌的研究中，发现壳聚糖降低了扩展青霉引起的红枣青霉病的发生[4]，纳他霉素和壳聚糖的协同作用，可以防治链格孢霉引起的红枣黑斑病；百里香精油具有抗真菌活性，可延长红枣的贮藏期。

红枣霉变主要是由于受湿度和温度的影响。红枣过干或者过湿都会影响其口感。在红枣水分活度一定的情况下，适当地采用红枣保鲜剂与抑菌剂有助于提高红枣的保质期和商品率。纳他霉素能够很好地抑制红枣中黄曲霉和黑曲霉的生长，可以用于红枣采后保鲜与病害防治。还可以研究复配抑菌剂，综合利用每种抑菌剂的抑菌谱，合理使用抑菌剂含量，达到最好的抑菌特性。研究为红枣采后、保藏、运输、销售的防治腐败变质提供理论依据。