国家东南区鲜食糯玉米品质及农艺性状与SSR标记遗传多样性分析

仇律雯， 杨 扬， 范亚明， 田红丽， 易红梅， 王 璐， 任 洁， 葛建镕， 王凤格， 陆大雷

(1.江苏省作物遗传生理重点实验室/江苏省作物栽培生理重点实验室/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心/扬州大学农学院，江苏扬州 225009； 2.北京市农林科学院玉米研究中心/玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室，北京100097)

糯玉米别称黏玉米、蜡质玉米，籽粒中支链淀粉含量接近100%，可在乳熟期收获果穗用于鲜食，具有很高的营养价值和经济价值，其相关产业发展潜力巨大，是近年来我国种植业结构调整、贯彻落实乡村振兴战略、拉动地方经济增长的首选作物。我国作为世界上糯玉米种植面积最大的国家，对糯玉米的规划和发展尤为重视，主要表现在以下方面：2000年，糯玉米作为鲜食玉米纳入国家品种管理，其选育品种开始参加国家级鲜食玉米区域试验；2008年，全国农业技术推广服务中心品种管理处对鲜食玉米品种区域试验进行了改革完善，将我国糯玉米种植区域划分为东南、西南、东华北、黄淮海4个大区。东南区由于气候适宜、经济较为发达、当地居民喜食糯玉米等原因一直是参试品种数量最多的区域。随着人们生活水平的提高和膳食结构的变化，人们对于鲜食糯玉米营养、口感的要求也在不断提高，使得选育和推广产量合格、品质达标的鲜食糯玉米新品种成为东南地区糯玉米产业健康发展的关键。区域试验是新品种选育和推广的重要环节，参试品种代表了糯玉米的育种动向和选育水平，应用分子标记、形态学标记分析东南地区鲜食糯玉米参试材料的遗传多样性，探索不同遗传背景下糯玉米农艺、品质性状差异对于该地区鲜食糯玉米产业的可持续发展具有重要意义。

农艺性状、品质性状是形态学标记的重要组成部分，其中农艺性状是玉米区域试验中衡量参试样品是否能在相应区域种植的主要指标；由于鲜食特用玉米的需求，糯玉米的籽粒品质在品种评价中同样占有举足轻重的地位。目前常用的分子标记有简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)标记和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记，其中SSR标记灵敏度高、重复性强，能够在品种间稳定遗传，已经被广泛应用于玉米、水稻、小麦等作物的遗传多样性分析和指纹图谱构建。基于SSR标记对供试材料进行聚类分析，同时结合具有代表性的优良品种能够准确划分组群，了解样品的遗传背景，反映样品间的遗传差异。糯玉米属于异花授粉作物，是杂种优势利用的典型，其杂交种的遗传背景主要取决于杂优模式中亲本的遗传组成。杂优模式不同使得亲本间的遗传差异较大，使得选育出的品种表现出不同的遗传背景。胡俏强等利用玉米50 K芯片将90份鲜食玉米资源划分为4个不同遗传背景的类群，并依此分析了温-热带杂优模式的农艺、品质和抗性特点，为鲜食玉米品种选育提供了新方向。在杂交种方面，韩晴等基于SSR标记将50个糯玉米品种划分为3个主要类群，并分析了每个类群的品质、农艺性状的变异程度，为糯玉米新品种的改良提供了基础。目前针对糯玉米品质及农艺性状与SSR标记的遗传多样性分析多以某一省份为分析单元，同时对多个省份糯玉米材料进行多样性研究的报道甚少，对东南区鲜食糯玉米参试品种的杂优模式和相关农艺、品质性状的研究尚未见报道。

本研究以2018年、2019年国家东南区糯玉米参试品种为材料，通过形态学标记、分子标记探究东南区糯玉米品种在不同遗传背景下品质、农艺性状的差异，以期为今后全面了解东南区糯玉米不同杂优模式所育成品种的农艺、品质性状特点提供参考，对相应地区糯玉米新品种改良及资源高效利用具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的41份材料为2018年、2019年参加国家东南区鲜食玉米区域试验的糯玉米区试品种，其中形态学标记对照为苏玉糯5号，分子标记定标品种为当前具有广泛代表性的对照品种或大面积推广的品种，分别为苏玉糯5号、京科糯2000、渝糯7号和郑黄糯2号。

1.2 农艺与品质性状及其测定

农艺性状包括株高、穗长、穗行数、千粒鲜质量、出籽率、产量等6个参数，相关数据均来自国家东南区鲜食玉米区域试验江苏省农业科学院粮食作物研究所试验点区试报告。

品质性状包括籽粒淀粉含量、直链淀粉含量、皮渣率、含水率、蛋白质含量和淀粉糊化温度。其中淀粉含量按照GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》用蒽酮比色法测定，直链淀粉含量参照GB 7648—1987《水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉测定法》测定。皮渣率参考农业农村部试行方法进行测定。含水率=(百粒鲜质量-百粒干质量)/百粒鲜质量×100%。利用凯氏定氮法测定籽粒氮含量(蛋白质含量=氮含量×6.25)。糊化温度相关测定方法见文献[18]。

1.3 SSR标记的选择及其试验方法

1.3.1 基因组DNA的提取 采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取供试材料的基因组DNA，用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)紫外分光光度计测定DNA的质量和浓度，并根据测量值将工作液浓度调至200 ng/μL。

1.3.2 SSR标记的选择 本研究选用的40个SSR标记为中国玉米审定品种标准DNA指纹库建库标记，引物名称、参数等具体信息见文献[19]。

1.3.3 PCR扩增及荧光毛细管电泳 PCR扩增反应体系为20 μL，其中包括2 μL DNA模板、0.25 μL引物、10 μL 2×Plus Master Mix和7.75 μL ddHO。PCR扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性40 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min，扩增产物于4 ℃保存。

采用10重PCR产物电泳检测的方法，将10对PCR产物混合后取2 μL于96孔电泳板中，加入 10 μL 去离子甲酰胺、0.2 μL GS3730-500分子量内标，置于PCR仪器中于95 ℃变性5 min，将变性后所得产物离心(2 000 r/min，30 s)后置于ABI3730XL DNA分析仪上进行荧光毛细管电泳，预电泳时间为2 min，电压为15 kV，电泳时间为 20 min，电压为15 kV。

1.4 数据分析

用Excel 2016统计分析12个农艺及品质性状数据的最大值、最小值、平均值、变异系数和Simpson多样性指数。Simpson多样性指数计算公式见文献[20]。在SPSS 25中采用非参数检验对聚类各组农艺及品质性状进行差异性分析。用ABI3730XL DNA分析仪上自带的Date Collection V1.0软件收集电泳后的原始数据并形成FSA文件，用SSR Analyser V1.2.4指纹分析器对FSA文件进行基因分型分析。使用PowerMarker V3.25软件统计41份糯玉米材料的等位变异数、基因型数、杂合度和多态信息含量(polymorphism information content，PIC)等信息，同时计算材料间的Rogers 1972遗传距离，得到非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)聚类结果，并用EvolView V 2.0软件对聚类结果进行修饰，得到UPGMA系统发生树形图。

2 结果与分析

2.1 供试材料的遗传多样性分析

2.1.1 品质及农艺性状多样性分析 对41份糯玉米材料的12个农艺及品质性状进行统计分析。由表1可知，不同糯玉米材料的形态学标记存在差异，12个性状的变异系数在1.72%～36.10%间变化，平均值为14.06%。6个农艺性状中千粒鲜质量的变异系数最大，为12.01%；出籽率的变异系数最低，为5.28%。6个籽粒品质性状中直链淀粉的变异系数最高，为36.10%；糊化温度的变异系数最低，为1.72%。12个性状的Simpson指数在0.69～0.83之间，平均值为0.78，其中含水率和产量的Simpson指数最高，为0.83。由描述性统计结果可以看出，41份供试材料的表型性状多样性较高。

表1 41份糯玉米材料的农艺、品质性状描述

2.1.2 SSR标记基因多样性和多态性分析 41份糯玉米材料在40个SSR标记上共检测出321个等位基因，平均每个SSR标记检测出8.025个等位基因。由表2可以看出，40个SSR标记的基因多样性在0.186～0.877之间，平均值为0.687；PIC值在0.179～0.866之间，平均值为0.658。引物P18扩增产物的基因多样性和PIC值均最低，引物P40扩增产物的基因多样性、PIC值均最高。在40个SSR标记中，PIC值>0.5的高多态性标记达36个，占全部标记数的90%，表明本研究所选标记能够有效反映供试材料的遗传多样性信息。

表2 40个SSR标记的多态性信息

2.2 参试材料的遗传背景分析

由图1可知，基于Rogers1972遗传距离矩阵将45份供试材料分为4个大组，在系统发生树上用不同颜色的线条标志4个聚类分组，以京科糯2000为代表的第Ⅰ组材料数量最多，共有20份，占供试材料总数的44.4%；第Ⅱ组以苏玉糯5号为代表，共有12份材料；以郑黄糯2号为代表的第Ⅲ组材料数量最少，只有6份；有7份材料被分在第Ⅳ组，组内代表品种为彩甜糯6号。

2.3 不同遗传背景下糯玉米的农艺及品质性状分析

分析各个聚类分组的形态学标记特点可知，在产量性状方面，聚类Ⅰ组的产量、千粒鲜质量分别为14 354.19 kg/hm、433.39 g，其均值高于另外3个组别。在籽粒品质方面，4个聚类分组的含水率均值为59.56%～63.79%，直链淀粉含量的均值为2.28%～3.04%，皮渣率的均值变化幅度较小，其中聚类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的皮渣率均在10%左右。为了探究不同遗传背景下糯玉米材料在农艺、 品质性状上是否存在显著差异，对聚类各组的形态学指标进行非参数检验。表3结果表明，12个农艺、品质性状中有3项指标在组间存在显著差异，分别为株高、千粒鲜质量和含水率。聚类Ⅰ组的千粒鲜质量、含水率高于其他组，株高较低；聚类Ⅱ组的含水率、株高较低，千粒鲜质量较高；聚类Ⅲ组的千粒鲜质量低于其他组，含水率、株高表现为平均水平；聚类Ⅳ组的株高较高，含水率在4个组中较为居中，千粒鲜质量较低。将组间存在显著性差异的3项指标数据标准化后标注在系统发生树末端，以圆形面积代表指标的数值，面积越大表示数值越高，详见图1，并观察面积差异最大的2组，发现各项指标的标注结果与非参数检验结果一致。

表3 4个聚类分组的农艺、品质性状非参数秩和检验结果

3 讨论与结论

遗传多样性作为生物多样性的最重要来源，是物种多样性的基础。形态学标记、分子标记是研究物种遗传多样性的2个主要标记，利用形态学标记来检测作物的表型变异简单易行，可以直观地展示品种特点。与形态学标记相比，分子标记排除了环境和人为因素影响，同时在品种间稳定遗传，能够准确反映样品间的遗传差异。本研究利用形态学标记和分子标记研究国家东南区鲜食糯玉米区试材料的遗传多样性特点，发现其有丰富的农艺、品质性状变异和SSR标记基因多样性。与陆大雷等于2002—2014年关于东南区参试材料的研究结果相比，本研究所选材料在产量、出籽率和千粒鲜质量3个指标上有所提升。与王凤格等在2004—2009年进行的鲜食玉米区试结果相比，本研究所选材料的等位基因数目、PIC值均有所提高。由此可见，随着育种技术的发展和杂优模式的创新，糯玉米的部分农艺指标在逐渐提优，在分子层面上也表现出越来越丰富的遗传变异。与杨扬等在2012—2019年进行的东南区糯玉米审定试验结果相比，本研究所选区试材料的PIC值、基因多样性无较大变化，两者的地理来源、育成年份高度相关，从侧面验证了本研究SSR标记结果的可靠性。

聚类分析结合代表性品种能够明晰供试材料的遗传背景，判断材料间的亲缘远近。刘少荣等利用5个国家级区域试验对照品种、2个大面积推广品种作为代表样品，将2002—2020年通过审定的青贮玉米划分为5个大组。杨扬等利用8个当前糯玉米区试对照品种和大面积推广品种分析了近10年来糯玉米审定品种的年份和地域特征。卢媛等在分析糯玉米自交系SSR标记遗传多样性时，也加入了4份与自交系材料相关的杂交种作为内参，用以验证其结果合理可靠。本研究以京科糯2000、苏玉糯5号、彩甜糯6号和郑黄糯2号为代表品种，对东南区41份糯玉米区试材料进行聚类分析，将其划分为4个遗传背景不同的组群。根据每个组群材料数量推测，目前东南地区糯玉米杂优模式以京科糯2000为代表的京糯6×BN2为主，该杂优方法创新并建立了硬粒型×马齿粉质型杂交选育模式，随着京科糯2000的推广而逐渐被各个育种单位和育种家借鉴。其次是以苏玉糯5号为代表的组群Ⅱ，对应的通系5类群×衡白522类群杂优模式在很长一段时间内都是东南区江苏省糯玉米的主要杂优模式之一。第Ⅲ组代表品种郑黄糯2号，其母本郑黄糯03来源于郑白糯01×郑58，其父本郑黄糯04来源于(紫香玉×昌7-2)×昌 7-2， 利用回交转育将糯质基因导入优质普通玉米中，从而获得糯玉米新品种，是糯玉米早期的主要育种方式之一。第Ⅳ组材料多为甜糯玉米，其代表品种彩甜糯6号是由白糯玉米自交系T37和紫色甜糯双隐性自交系WH818杂交选育而来。

不同于普通玉米，糯玉米独特的鲜食用途决定了其特殊的农艺、品质育种目标，在满足产量指标的同时尽可能地兼顾营养与口感是育种家对于鲜食糯玉米新品种的总体要求。分析不同遗传背景下糯玉米材料的农艺、品质性状差异，能够在为育种家和育种单位提供导向作用的同时有效利用育种资源，有助于优良品种的选育。本研究通过SSR标记明确了41份糯玉米区试材料的遗传背景，利用非参数检验分析不同遗传背景下糯玉米的农艺与品质特点，发现了3个组间存在显著差异的形态学指标，其中籽粒鲜质量为主要的产量性状之一，含水率则与糯玉米的品尝口感呈显著负相关。4个遗传背景不同的组群在产量、品质性状上表现出不同的特点：在产量性状方面，聚类Ⅰ组表现优异，千粒鲜质量高于其他组别，平均产量也高于另外3组；其中Ⅰ组代表品种京科糯2000通过了国家和20多个省份的审定，与其他组代表品种相比，其在区域试验中所测千粒鲜质量、产量均表现优异。从品尝口感的角度看，聚类Ⅱ组的含水率较低，且组内品种皮渣率均值也较低，表现出较好的适口性。本研究基于形态学标记、分子标记首次分析了东南地区糯玉米区试材料在不同遗传背景下农艺及品质性状表现，可供参考的研究报道较少，其结果可为今后全面了解该地区糯玉米不同杂优模式所育成品种的农艺及品质性状特点提供依据。