山苍子油超临界CO2萃取工艺及其成分分析

殷 勇，王雪雅，彭世清，白立伟，史勋祝，杨秋燕，杜 雄，何建文*

(1.贵州省农业科学院 辣椒研究所，贵州 贵阳 550006；2.麻江县明洋食品有限公司，贵州 麻江 556000；3.沿河县和平街道办事处，贵州 沿河 565300)

山苍子(Litseacubeba)属于樟科木姜子属的小乔木，也叫赛樟树、山鸡椒、木姜子等。山苍子精油是一种复杂的混合物，主要成分为萜烯和萜类化合物[1-3]。由于柠檬醛含量最高，山苍子精油通常可用于提取柠檬醛，提取出来的柠檬醛又可用来合成紫罗兰酮类、维生素等[4-6]。山苍子具有类似柠檬味的香气，风味纯正，独特，同时含有锌、硒等微量元素，是一种对健康有益的食物。山苍子既可鲜食，又可提出山苍子油后加工制成调味品[7-9]，具有良好的食用品质及安全性。

超临界CO2提取法最能够保持山苍子精油的原生特性，超临界CO2流体的萃取温度与室温接近(35～40 ℃)，且在避光条件下进行，特别利于对湿、热、光等敏感的物质以及芳香性物质的提取[10-13]。挥发油类成分极性较小，沸点较低，易溶于CO2超临界流体，又由于大多数挥发性油性质不稳定，在常规的水蒸气蒸馏条件下易造成挥发油的分解或氧化，且回收率较低[14-15]。而超临界CO2流体可以克服蒸馏法缺点，所得的产品回收率高、品质好，故对挥发性油的提取效果具有其他技术不可比拟的优势[16]。避免了溶剂提取法、蒸馏法中精馏加热所造成的油脂氧化、酸败和有机溶剂残留等问题，克服了压榨法精制过程中造成的芳香油挥发、色泽变暗等缺点。本文就超临界CO2流体技术对山苍子油的提取工艺进行了研究，对开发超临界CO2提取山苍子油工艺及利用山苍子油具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山苍子：采自贵州省毕节市赫章县，新鲜、成熟、无腐烂，去杂质，40 ℃烘干粉碎成20、40、60、80目备用。试剂：CO2(纯度99.99 %)；无水硫酸钠(分析纯)；无水乙醇(色谱纯)。仪器设备：ASI超临界萃取仪，SFE-2(美国 Applied SeParations Inc)；低温恒温槽，SDC-6(南京宁凯仪器有限公司)；万能粉碎机，FW80(永康市红太阳机电有限公司)；电热鼓风干燥箱，DHG-9240A(上海煜南仪器有限公司)；气相色谱-质谱联用仪，Trace ISQ(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 试验方法

1.2.1超临界CO2萃取工艺流程

超临界CO2萃取工艺流程如图1所示。

图1 超临界CO2萃取工艺流程图Fig.1 Flow chart of supercritical CO2 extraction process

1.2.2山苍子油提取率的计算[17]

取10 g山苍子粉末置于萃取釜中，按照CO2超临界流体萃取仪操作流程，最后将收集瓶中所得的山苍子油进行准确称量(g)。

山苍子提取率=(山苍子油质量/山苍子原料质量)×100%

1.2.3单因素试验

分别考察萃取压力、温度、时间、颗粒粒度及CO2流量对山苍子油提取率的影响，以较优条件为基数[18]，设计变量取值，进一步优化条件。

设置试验萃取压力为20 Mpa，CO2流量为7.5 L/h，取10 g过40目筛的山苍子粉末，在温度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下萃取30 min。

设置萃取温度50 ℃，CO2流量7.5 L/h，取10 g过40目筛的山苍子粉末，萃取压力设置为20 Mpa、30 Mpa、40 Mpa、50 Mpa萃取30 min。

设置萃取温度50 ℃，压力40 Mpa，取10 g过40目筛的山苍子粉末，将CO2流量设置为2.5 L/h、5 L/h、7.5 L/h、10 L/h下萃取30 min。

设置萃取温度50 ℃，压力40 Mpa，CO2流量为7.5 L/h，取10 g过20、40、60、80目筛的山苍子粉末萃取30 min。

设置萃取温度50 ℃，压力40 Mpa，CO2流量为7.5 L/h，取10 g山苍子粉末，分别在15 min、30 min、45 min、60 min进行萃取。

1.2.4正交试验

依据单因素试验结果进行正交试验，以山苍子油提取率为指标进行测定，最终确定超临界CO2流体萃取山苍子油的最佳工艺条件。

1.2.5验证试验

按照正交试验优化得出的操作条件进行超临界CO2流体萃取山苍子油试验，平行试验3次，考察最佳条件的可靠性和稳定性。

1.2.6气相色谱条件和质谱条件[19]

色谱柱为HP5MS石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm，5%苯基95%甲基聚硅氧烷)；程序升温：柱初始温度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速度升温至120 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速度升温至250 ℃，保持5 min；载气为高纯氦气，柱前压50 kPa，流速：1 mL/min；乙醚以1∶10稀释；进样量：0.1 μL；溶剂延迟：4 min；进样口温度：220 ℃；分流比1∶40。电离源：EI源；电离电压：70 eV；质量扫描范围：35-500 m/z；四级杆温度：150 ℃；离子源温度：240 ℃；接口温度：260 ℃；光电倍增管电压：1024 V。

1.3 数据处理

采集GC-MS所得到的质谱图，利用NIST谱库进行检索分析，同时结合有关文献[20]的保留指数对化合物进行定性分析，利用峰面积归一化法对色谱峰进行归一化处理，对各组分进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 超临界CO2萃取处理山苍子单因素试验结果与分析

2.1.1萃取温度对山苍子油提取率的影响

如图2所示，山苍子油提取率随温度的升高而增加，当温度上升到50 ℃时，山苍子精油提取率达到最高值，为12.9%，继续提高温度，山苍子油提取率下降，萃取温度在40 ℃时与其余温度有显著差异(P<0.05)，其余三个温度下没有显著差异(P>0.05)。由此说明当温度达到50 ℃后，继续提高萃取温度对山苍子油的提取率影响不大，可见温度对超临界CO2萃取能力的影响具有双重效应，升温一方面增加了物质的扩散系数而利于萃取，另一方面却因为降低了CO2的密度，使物质的溶解度降低而不利于萃取。通过对萃取温度进行单因素试验，获得山苍子油的最佳萃取温度为50 ℃。

图2 温度对提取率的影响Fig.2 Effect of temperatures on the extraction rate of L. cubeba

2.1.2萃取压力对山苍子油提取率的影响

由图3可知，随着萃取压力的升高，山苍子油提取率呈先上升后下降的趋势，压力为40 MPa时，山苍子油提取率最高，为13.47%，与其他处理组呈显著性差异(P<0.05)。当萃取压力升高到50 MPa时，山苍子油提取率下降至11.93%。压力的升高，导致CO2流体密度增大，进而影响提取物的溶解度，使山苍子在流体中的溶解度增大，继续升高压力，导致CO2扩散系数减小，CO2流体溶解度降低，造成CO2流体溶解度大于CO2流体密度，进而出现提取率的下降[20]。通过对萃取压力进行单因素试验，获得山苍子油的最佳萃取压力为40 MPa。

图3 压力对山苍子油提取率的影响Fig.3 Effect of pressure on the extraction rate of L. cubeba

2.1.3CO2流量对山苍子油提取率的影响

由图4可知，山苍子油的提取率随着CO2流量的增加先升高后下降，CO2流量为2.5 L/h、5 L/h时，对山苍子油的提取率无显著性差异(P>0.05)，但与其余处理组呈显著性差异(P<0.05)。在2.5 L/h时，由于流速过慢，传质推动力较小，萃取能力不佳，提取率较低，当CO2流量在 5 L/h以上时，山苍子油的提取率提高得很快，达到7.5 L/h时，提取率最高，为13.27%。CO2流量的增加，导致CO2气体与山苍子提取物的传质推动力增大，使溶剂与提取物的碰撞几率变大，传质过程增强，提取率也随之升高。随着CO2流量的增加，山苍子油在山苍子粉和CO2之间的浓度差逐渐趋近最大浓度差，CO2对山苍子油的萃取率不再随流量的增加而明显变化。由此得出，萃取山苍子油最佳CO2流量为7.5 L/h。

图4 CO2流量对提取率的影响Fig.4 Effect of CO2 flow on the extraction rate of L. cubeba

2.1.4颗粒粒度对山苍子油提取率的影响

由图5可知，随着山苍子颗粒粒度的增大，山苍子油的提取率呈先上升后下降的趋势，各处理组的提取率呈显著差异(P<0.05)。颗粒粒度20～40目时，山苍子油提取率增加较快，当颗粒粒度为60目时，山苍子油提取率最高，为13.8%，可见随着山苍子颗粒粒径的减小，增大了山苍子颗粒的表面积，能够增大与CO2的接触面积，有利于山苍子颗粒的溶解，同时提高了山苍子细胞破碎程度，减小了细胞壁对山苍子油的束缚作用及从基质中扩散出来的距离，消除了扩散障碍，利于萃取过程的进行。当山苍子粒度继续减小，有可能会使山苍子颗粒随着流体一起被带出，也会形成高密度床层，阻塞溶剂流通通道，使传质速率下降，萃取率随之受到影响，因而出现提取率下降的现象。通过对物料粒径进行单因素试验，获得山苍子油提取的物料最佳粒径为60目。

图5 颗粒粒度对山苍子油提取率的影响Fig.5 Influence of particle size on extraction rate of L. cubeba

2.1.5萃取时间对山苍子油提取率的影响

由图6可知，随着时间的增加，山苍子油提取率不断上升，当提取时间为15 min时，山苍子油提取率最低，为9.73%，与其余提取时间呈显著性差异(P<0.05)；随着萃取时间的增加，山苍子油的提取率上升速率快，到30 min时，山苍子油的提取率为12.91%；继续增加提取时间，山苍子油的提取率变化无显著性差异(P>0.05)。原因可能是试验开始时，CO2流体渗入原料的时间不足，CO2流体与山苍子提取物的溶解达到动态平衡，需要一定的时间积累，接近30 min时，基本达到稳定。由此，获得山苍子油最佳提取时间为30 min。

图6 萃取时间对山苍子油提取率的影响Fig.6 Influence of extraction time on extraction rate of L. cubeba

2.2 超临界CO2萃取山苍子油正交试验结果分析

根据单因素试验得出的各组最优条件，即最佳萃取压力为40 Mpa，最佳CO2流量为7.5 L/h，最佳颗粒粒度为60目，最佳萃取时间为30 min，采用正交试验方法进行设计，如表1。

表1 试验正交因素与水平Tab.1 Orthogonal factor and level in experiment

正交试验结果如表2所示，根据综合评分显示的极差大小，各因素的影响程度为A>C>B>D，即萃取压力>颗粒粒度>CO2流量>萃取时间；试验结果的方差分析如表3所示，试验各因素均对试验结果有显著影响(P<0.05)。综合方差分析、极差分析结果，得到山苍子CO2超临界萃取最佳工艺为A3C3B3D1，即萃取压力为45 MPa、CO2流量9 L/h，颗粒粒度50目，萃取时间30 min，萃取温度50 ℃。

表2 L9 (34)正交试验方案与结果Tab.2 L9 (34) Orthogonal experimental protocol and results

表3 正交试验方差分析Tab.3 Orthogonal test analysis of variance

按照正交试验得出的最佳工艺，在萃取温度50 ℃、萃取压力45 MPa、CO2流量9 L/h，颗粒粒度50目，萃取时间30 min下进行3次重复操作，得到的山苍子油平均提取率为14.35%，试验结果符合预期，试验稳定可靠。

2.3 山苍子油挥发性成分分析

经提取，山苍子油样品的挥发性成分共发现36个组分(表4)，选取占总峰面积91.25%的目标色谱峰(图7)，通过NIST标准谱库检索对目标化合物的可能结构进行定性分析，得到以下结果。

图7 山苍子油的总离子流图Fig.7 The tolal ion chromatogram of L. cubeba oil

表4 山苍子油的成分分析Tab.4 Analysis of the composition of L. cubeba oil

在不同类别组分的相对含量分析中，各类组分峰面积之和分别占总峰面积的百分比如下：单萜含氧衍生物78.73%、单萜类化合物18.64%、倍半萜类化合物1.23%、芳香族化合物 1.14%。其中单萜及其含氧衍生物是山苍子果实挥发性成分的主要物质，这2类组分的峰面积之和占总峰面积88.84%，含量较多的是α-柠檬醛(38.9%)、β-柠檬醛(21.01%)及柠檬烯(8.16%)。

从单个组分的相对含量分析，山苍子挥发油中的主要成分为α-柠檬醛、β-柠檬醛、柠檬烯、芳樟醇，4种成分所占比例达到75.87%，其中柠檬醛含量为65.44%，甲基庚烯酮、芳樟醇的含量比陶能国等[22]的研究成分高。柠檬醛是一种α-二烯醛，也是一种不饱和醛，呈浓郁柠檬香味，具有抗菌、抗氧化等多种生物活性，主要用于配制柠檬、草莓、苹果等水果型香精[23]；其次相对较高的含量物质为甲基庚烯酮(5.16%)、香茅醛(2.91%)、香叶醇(1.76%)、环己烯(1.43%)。山苍子提取油具有辛香、木香及隐约的柠檬香气[24]，由表4的分析结果可知，对香气贡献较大的化合物除上述含量较高的8种外，主要还有甲酸香叶酯、异戊酸香叶酯、氧化芳樟醇、月桂酸甲酯、香茅醛、马鞭草烯酮等。其中α -柠檬醛、β-柠檬醛、香茅醛等是柠檬香气的主要来源；α-松油醇甲酸香叶酯、异戊酸香叶酯、月桂酸等是辛香、脂蜡味、草本样香气的主要来源，芳樟醇、α -松油醇、β-石竹烯、乙酸香叶酯等是木香的主要来源[25]。

3 结论与讨论

山苍子油具有较好的芳香特性，也是我国重要的食用香料，并具有显著的抑菌、祛痰、抗心律失常等作用[26]。目前，获取山苍子油多采用水蒸气蒸馏的方法，用有机溶剂或压榨法获取山苍子油，工艺均较简单、原始、得油率较低，提取的山苍子油品质较差，质量不稳定。超临界CO2流体的萃取温度与室温接近(35～40 ℃)，且在避光条件下进行，特别利于对湿、热、光等敏感的物质以及芳香性物质的提取[27-29]。挥发油类成分极性较小，沸点较低，易溶于CO2超临界流体，又由于大多数挥发性油性质不稳定，在常规的水蒸气蒸馏条件下易造成挥发油的分解或氧化，且回收率较低[30-31]。选取超临界CO2提取法最能够保持山苍子精油的原生特性的萃取方法，可以最大程度保护山苍子油的品质。本研究通过单因素及正交试验，得到超临界CO2提取的最佳工艺为萃取温度50 ℃、萃取压力45 MPa、CO2流量9 L/h、颗粒粒度50目、萃取时间30 min，在此条件下山苍子油提取率最高为14.35%。比目前常用的高压蒸气蒸馏技术提取山苍子油的提取率高2.6倍[32]，比超声辅助减压蒸馏技术的提取率高出2倍[33]，比水蒸气蒸馏法的提取率高3.7倍[34]，因此超临界 CO2萃取山苍子油具有工艺简单、操作方便、得油率高等传统工艺不可比拟的优点。

通过GC-MS分析发现，山苍子油有36个不同组分，其中主要成分为α-柠檬醛、β-柠檬醛、柠檬烯、芳樟醇，4种成分所占比例达到75.87%，柠檬醛成分高达65%以上。结果同何金明等[35]的研究相似，通过对山苍子油各主要成分含量的分析，可知山苍子油的特征风味是由多种芳香物质综合而来，其中主要成分柠檬醛，是山苍子油风味的主要呈味物质，柠檬醛含量对山苍子品质有正相关关系，在食品加工、天然香料及综合利用等方面开发利用山苍子资源提供了科学依据。