芪参还五胶囊对大鼠帕金森病核受体相关因子1表达的影响及机制*

郑建彪， 王雯， 邱志新， 景海芳

(1.沧州中西医结合医院 脑病二科, 河北 沧州 060001； 2.沧州中西医结合医院 神经康复二科, 河北 沧州 060001)

帕金森病(parkinson's disease，PD)是老年人常见的中枢神经系统疾病，临床主要表现为运动系统功能紊乱，如静止性震颤、运动迟缓和僵硬[1]，PD的发病机制尚不完全清楚[2]。核受体相关因子1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)基因是核受体超家族的转录因子，包括脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)结合域、配体结合域和AFL结合域，AFI结合域可通过促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)途径激活，在调节多巴胺能神经元发育中有重要作用[3]；研究证实Nurrl在中脑多巴胺能神经元的发育、迁移和存活中起着重要作用[4-5]；在对人外周血淋巴细胞的研究中发现，PD患者的Nurr1基因信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)含量明显低于正常人，因此可将Nurrl作为PD潜在的、新的治疗靶点[6]。研究显示，在补阳还五汤的基础上，以人参、驱虫药、冰片为主要成分的芪参还五胶囊在临床治疗急性缺血性中风方面有良好的疗效[7]，还能改善血管性认知障碍非痴呆患者的认知功能，调节脂质代谢、缓解减轻炎症反应、促进神经功能恢复[8-9]。因此，本研究通过内侧前脑束单位点注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)建立PD大鼠模型，采用不同剂量的芪参还五胶囊进行治疗，观察PD大鼠Nurr1表达水平，报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1实验动物 (1)SPF级健康雄性SD大鼠10只，用于预实验，体质量182～219 g、平均(200.65±6.12)g，标准饲养；(2)SPF级健康雄性SD大鼠30只用于分组实验，体质量180～220 g、平均(201.32±5.42)g，标准饲养；大鼠均购于湖北省实验动物研究中心，许可证号SCXK(鄂)20210042，研究中动物处理符合《ethical issues in animal experimentation》[10]标准。

1.1.2主要设备与试剂 (1)设备：大鼠脑立体定位仪(51650，美国Stoelting公司)，高速颅骨钻(ZH-GSZ，美国Stoelting公司)；(2)试剂：芪参还五胶囊(河北省沧州中西医结合医院的院内制剂，冀药制字Z20050798)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，含各种氨基酸和葡萄糖培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)液(美国赛默飞公司)，总RNA提取试剂(Trizol，美国invitrogen公司)，实时荧光定量(real time flurocent qualitative，PCR)试剂盒，逆转录试剂盒，RNase-free H2O(大连TakaRa公司)，谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase system，GSH-Px)、谷胱甘肽-S转移酶(glutathione -S transferase，GSH-ST)试剂盒、细胞增殖及毒性检测(cell counting kit-8，CCK-8)试剂(中国碧云天)，磷酸化蛋白激酶B(phosphorylase kinase B，p-AKT)，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)抗体，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)-山羊抗兔(中国中杉金桥生物技术有限公司，引物(美国invitrogen公司)。

1.2 研究方法

1.2.1芪参还五胶囊剂量确定实验 研究前期预实验确定芪参还五胶囊对帕金森大鼠的剂量：10只SPF级健康雄性SD大鼠用0.50～5.00 g/(kg·d)剂量芪参还五胶囊溶液灌胃，每0.50 g/(kg·d)为一个阶梯，观察大鼠的炎性反应情况和细胞活力，发现芪参还五胶囊低于0.50 g/(kg·d)时大鼠无明显影响、剂量高于4.00 g/(kg·d)时大鼠死亡；同时结合芪参还五胶囊成人给药剂量为2.4 g/d，根据人(60 kg)和大鼠按照体表面积折算的等效剂量比值换算出大鼠给药剂量，设置本研究内低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠所用芪参还五胶囊剂量。

1.2.2动物分组及造模 将30只SD大鼠均分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型对照组和正常对照组，前4组大鼠参考文献[11]的方法在大鼠内侧前脑束单位点注射6-OHDA建立帕金森病模型：大鼠腹腔注射4%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后、固定在脑立体定位仪上，剔除头颅毛发，沿中线切开头颅皮肤，显露前、后囟，在前囟后2.20 mm、中线旁开2.10 mm、颅骨表面下8.5 ～8.7 mm处用微量注射器注射6-OHDA 1.5 μL，拔针缝合伤口，术后连续3 d注射8万单位青霉素钠；大鼠术后每周向颈部肌肉注射盐酸阿扑吗啡(0.5 mg/kg)，连续4周进行旋转试验，如果转速>7 r/min则认为模型成功，如果旋转试验时旋转方向不正确或旋转次数不足，则视为造模失败；正常对照组大鼠手术钻孔、但不注射6-OHDA。低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠造模成功第2天分别给予0.93、1.87及3.75 g/(kg·d)剂量芪参还五胶囊灌胃，模型对照组和正常对照组给予等量生理盐水灌胃，各组均灌胃7 d。

1.2.3黑质纹状体组织匀浆制备及黑质纹状体细胞培养 造模后第7天和第14天时，每组分别各取3只大鼠麻醉后断头处死，分离脑组织于冰上的托盘，用眼镊将受损侧黑质纹状体分离并冷生理盐水中反复冲洗，并用滤纸干燥，均分为3份，一份置于5 mL烧杯中，加入2倍组织体积的匀浆介质，用眼科剪刀快速切碎黑质纹状体组织，倒入玻璃匀浆管匀浆后4 000 r/min离心15 min，用于后续实验；另一份参考文献[10]进行黑质纹状体细胞培养；第三份参考文献[12]进行黑质纹状体组织学切片，观察神经突触及微观结构。

1.3 观察指标

1.3.1比色法检测GSH、GSH-Px、GSH-ST含量 采用比色法检测，取大鼠黑质纹状体组织匀浆上清液，用721分光光度计测定匀浆中GSH、GSH-Px、GSH-ST吸光度值。

1.3.2白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、转化生长因子 (transforming growth factor-β，TGF-β)、Nurr1 mRNA水平 采用RT-PCR法检测，首先用Trizol法从大鼠黑质纹状体匀浆中提取总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA作为模板进行PCR扩增反应，扩增条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性45 s、59 ℃退火 45 s、72 ℃延伸60 s，共35个循环，以β-肌动蛋(β-actin)为内参照，计算IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA相对表达水平。IL-4上游引物序列为-AAGGCTGGCGGATTACTGCC，下游引物序列为-GATGCTGCTGGTGATGTACT；TGF-β上游引物序列为-GGAGTTTATCATCACCGCGGAAATACTGAGAG，下游引物序列为-TATTTCACTGACAGGCAATACCGTCCAAGG；Nurr1上游引物序列为-CTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCT，下游引物序列为-CAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCT。

1.3.3细胞活力 采用四甲基偶氮唑盐比色(methylthiazolyl tetrazolium test，MTT)法测定。于96孔板的每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃下孵育4 h，加入DMSO 150 μL摇动10 min，于酶标仪上检测490 nm处的吸光度值。参考文献[12]计算细胞活性。

1.3.4细胞侵袭能力 将大鼠黑质纹状体细胞浓度调整为2×107个细胞/L，将细胞悬液接种于包被或不包被Matrigel胶的Transwell上室中，培养液添加到下室，培养24 h，用多聚甲醛(4%)固定，结晶紫染色(0.1%)，显微镜下观察5个随机视野内结晶紫染色细胞数为细胞浸润数。

1.3.5细胞凋亡 采用流式细胞仪检测，将5×105对数生长的大鼠黑质纹状体细胞接种于培养瓶(75 mL)内，收集悬浮和贴壁细胞，在Annexin V-FITC488和PI溶液中室温避光孵育15 min，测定3次计算平均值。

1.3.6神经突触及微观结构 剥离黑质纹状体后，取1 mm3组织，在电镜固定液中固定24 h，常规锇酸固定，在CH型(OlyⅡlpus)透射电镜下染色，观察并拍照。每只大鼠选择3个区域(×8 200)计算突触数目，用游标卡尺测量突触活动区的长度和突触后膜致密物质的厚度(postsynaptic density，PSD)。

1.3.7AKt、p-AKt蛋白水平 采用蛋白印迹(Western blot)法检测，提取细胞总蛋白并进行处理，用聚氰基丙烯酸正丁酯法测定蛋白浓度，调平各组细胞的浓度，并取40 μg蛋白样品于聚丙烯酰胺凝胶电泳，在275 mA地电流下转移到聚偏氟乙烯(poly vinyli dene fluoride，PVDF)膜上(2 h)，封闭，加入p-AKT、AKT抗体(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加二抗(1 ∶800)，室温下培养2 h，行化学发光显影。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 GSH、GSH-Px、GSH-ST含量

结果显示，造模后第7天和第14天时，低、中、高剂量组及模型对照组大鼠的黑质纹状体组织匀浆中GSH、GSH-Px、GSH-ST含量均较正常对照组降低，低、中剂量组及模型对照组大鼠的黑质纹状体GSH、GSH-Px、GSH-ST含量均较高剂量组降低，且造模后第14天时低、中、高剂量组大鼠的黑质纹状体GSH、GSH-Px、GSH-ST含量随着芪参还五胶囊剂量的升高而升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 造模后第7天和第14天时各组大鼠黑质纹状体GSH、GSH-Px、GSH-ST含量Tab.1 Comparison of GSH, GSH-Px, and GSH-ST in rat substantia nigra and striatum on the 7thand 14th day after modeling in each group

2.2 IL-4、TGF-β及Nurr1 mRNA相对表达

结果显示，造模后第7天和第14天时，低、中、高剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA相对表达水平均较正常对照组升高，低、中剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA相对表达水平均较高剂量组升高，且造模后第14天时低、中、高剂量组大鼠的黑质纹状体IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA相对表达水平随着芪参还五胶囊剂量的升高而降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表2 造模后第7天和第14天时各组大鼠黑质纹状体IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA相对表达水平Tab.2 Comparison of IL-4, TGF- β, and Nurr1 mRNA in rat substantia nigra and striatum on the 7th and 14th day after modeling in each group

注：1、2为IL-4 mRNA第7天和第14天，3、4为TGF-β mRNA第7天和第14天，5、6为Nurr1 mRNA第7天和第14天。图1 RT-PCR检测各组大鼠黑质纹状体IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA电泳结果Fig.1 Electrophoresis result of IL-4, TGF- β, andNurr1 mRNA detected by RT-PCR

2.3 黑质纹状体细胞活力、细胞侵袭能力及凋亡率

结果显示，造模后第7天和第14天时，低、中、高剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体细胞活力和细胞侵袭能力较正常对照组降低、凋亡率较正常对照组升高，低、中剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体细胞活力和细胞侵袭能力较高剂量组降低、凋亡率较高剂量组升高，且造模后第14天时低、中、高剂量组大鼠的黑质纹状体细胞活力、细胞侵袭能力随着芪参还五胶囊剂量的升高而升高，凋亡率随着芪参还五胶囊剂量的升高而降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图2。

表3 造模后第7天和第14天时各组大鼠黑质纹状体细胞活力、细胞侵袭能力及凋亡率Tab.3 Comparison of cell viability, invasion, and apoptosis in rat substantia nigra and striatum on the 7th and 14th day after modeling in each group

2.4 神经突触数量、活性区长度及PSD水平

结果显示，造模后第7天和第14天时，低、中、高剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体内突触个数、活性区长度、PSD水平均较正常对照组降低，低、中剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体内突触个数、活性区长度、PSD水平均较高剂量组降低，且造模后第14天时低、中、高剂量组大鼠的黑质纹状体内突触个数、活性区长度、PSD水平随着芪参还五胶囊剂量的升高而降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

2.5 p-AKt、AKt蛋白表达水平

结果显示，造模后第7天和第14天时，低、中、高剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体内p-AKt蛋白表达水平较正常对照组降低、AKt蛋白表达水平较正常对照组升高，较正常对照组降低，低、中剂量组和模型对照组大鼠黑质纹状体内p-AKt蛋白表达水平和低剂量组大鼠黑质纹状体内AKt蛋白表达水平均较高剂量组降低，中剂量组和模型对照组大鼠的黑质纹状体内AKt蛋白表达水平均较高剂量组升高，且造模后第14天时，低、中、高剂量组大鼠的黑质纹状体内p-AKt水平随着芪参还五胶囊剂量的升高而升高，AKt水平随着芪参还五胶囊剂量的升高而降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、图3。

图2 不同时刻各组大鼠黑质纹状体的流式细胞结果Fig.2 Flow cytometry results of rat substantia nigra and striatum at different time points

表4 造模后第7天和第14天时各组大鼠黑质纹状体的神经突触数量、活性区长度及PSD水平Tab.4 Comparison of the numbers of synapses, the length of active length, and PSD in rat substantia nigra and striatum on the 7th and 14th day after modeling in each group

表5 造模后第7天和第14天时各组大鼠黑质纹状体的p-AKt、AKt蛋白表达水平Tab.5 Comparison of p-AKt and Akt protein expression in rat substantia nigra and striatum on the 7th and 14th day after modeling in each group

图3 各组大鼠黑质纹状体AKt、p-AKt蛋白相对表达水平(Western blot)Fig.3 Relative protein expression levels of Akt and p-AKt (Western blot)

3 讨论

PD是一种常见的神经退行性疾病，其主要临床表现为运动障碍，如步态快速、四肢僵硬、故意减少运动、静止性震颤、缓慢运动和智力低下，在严重的情况下，可能会出现谵妄，这在老年人中较为常见[13]。在PD中，典型的现象是黑质多巴胺(dopamine ,DA)神经元的退化，对人类外周血淋巴细胞中神经营养素水平的测量结果显示，PD综合征患者的神经营养素水平显著降低[14]。研究表明，成年小鼠Null+/-变化与中脑边缘和中脑皮质的DA水平降低有关，但纹状体的DA水平无明显变化[15]。这些小鼠也更容易受到1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Hydrochloride ，MPTP)诱导的黑质损伤。Maryam等[16]的研究也发现，老年Null+/-小鼠相比于正常的Null+/+小鼠和Null+/-小鼠，表现出明显的旋转和运动能力的下降。这些异常活动与黑质纹状体DA水平降低、黑质DA神经元和Nurr1表达减少以及DA转运体减少有关[17]。目前西医和外科治疗PD仅限于控制患者症状，但不能延缓或阻止患者黑质病变的发展，因此中药有望成为最佳治疗方案之一。

由人体代谢所产生的氧自由基生理状态可被酶系统清除，以达到缓解氧化损伤的效果。机体酶系统主要包括GSH-Px、GSH-ST等，PD患者脑内抗氧化系统和自由基清除系统功能低下，黑质-纹状体中GSH、GSH-Px、GSH-ST的含量均有程度不同的减少，自由基产量增加，对神经元造成严重损伤，因此GSH具有缓解氧化损伤的效果。黑质内GSH含量减少50%，则脑的清除自由基能力下降。若GSH-Px活力降低，则GSH-ST只有清除脂质过氧化物的作用。而氧化应激作为造成黑质细胞损伤的主要原因，其对神经元损伤、裂解、凋亡过程均有一定作用，可通过减少多巴胺的分泌，诱发PD的发生。因此本研究中观察大鼠黑质纹状体GSH、GSH-Px、GSH-ST含量可了解PD的发生。其次，IL-4、TGF-β作为临床常用的炎性因子，当机体出现炎症反应时，IL-4、TGF-β水平异常，而大量炎性因子浸润，可促进蛋白酶分泌增加，促进氧化中间产物的发生，进而诱发PD的发生。因此本研究中观察黑质纹状体IL-4、TGF-βmRNA水平也可了解PD的情况。近年来在6-羟基多巴诱导的PD模型中，川芎嗪类似物CXC195通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B /糖原合成酶激酶3β(phosphatidylin-ositol-3-kinase/protein kinase B/Glycogen synthase kinase3β，PI3K/Akt/GSK3β)保护多巴胺能神经元免于凋亡[18-19]。一些研究还发现PI3K/Akt信号转导与PD的炎症机制密切相关，E3泛素连接酶C-CB1抑制与PI3K/Akt信号通路相关的小胶质细胞介导的中枢神经系统炎症，p-Akt蛋白在炎症反应中显著降低，PI3K/Akt信号通路受到抑制，与其他文献结果相似[20]。本研究中，结果显示芪参还五胶囊可通过抑制PI3K/Akt信号通路，改善黑质纹状体的氧化还原反应，减轻炎症，降低细胞活力和侵袭能力，促进细胞凋亡。这是因为Nurr1是多巴胺能神经元形成的关键基因，其表达增强在体内外均有一定的抗炎作用。

同时，芪参还五胶囊具有益气活血、疏通散瘀、开窍醒脑的作用，方剂中川芎具有活血、气血、祛风止痛的功效[21]。冰片能延长小鼠耐缺氧时间，药代动力学研究表明，冰片口服5 min后可穿过血脑屏障，并在中枢神经系统蓄积，还可促进其他药物通过血脑屏障[22]。地龙、水蛭、白僵蚕等药物有祛风、化痰、祛结节的作用，这些动物药中含有大量的溶栓因子，如水解蛋白酶，不仅能溶解血栓和动脉粥样硬化斑块，还能软化血管，恢复动脉弹性，从而改善急性缺血性中风患者的脑循环，帮助建立侧支循环，具有双向调节作用[23-24]。当归既能促进血液循环，又能养血，能释放多余的血热，消除血瘀，产生血液；黄芪具有益气养血、强身健体、消除病因、提高免疫力、增强内环境稳定性等作用，其利尿作用对急性缺血性脑卒中引起的脑水肿有调节作用[25]。因此有文献指出，芪参还五胶囊在治疗急性缺血性中风时能明显改善神经功能缺损程度，提高临床疗效，同时还能改善患者的脂代谢紊乱，有效预防糖尿病的发生，且无不良反应或副作用。而本研究中模型对照组造模第7天和第14天时，黑质纹状体GSH、第7天时的GSH-Px、GSH-ST、细胞活力、突触个数、AKt蛋白表达及第14天时的活性区长度并未与低剂量组、中剂量组和高剂量组表现出明显差异，可能是因本文所设置样本量较少所致，同时一些实验变量的控制也可能对结果产生影响，但总体结果趋势并未受到明显影响，今后应进一步提高实验严谨性，确保所获取结果的准确性。

本研究结果显示，低、中、高剂量组及模型对照组大鼠的黑质纹状体GSH、GSH-Px、GSH-ST含量、细胞活力、侵袭能力、突触个数、活性区长度、PSD含量、p-AKt蛋白表达水平与正常对照组相比均降低；IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA水平，细胞凋亡率和AKt蛋白表达水平均显著升高，且在造模后第14天时低、中、高剂量组大鼠的黑质纹状体GSH、GSH-Px、GSH-ST含量、细胞活力、细胞侵袭能力、突触个数、活性区长度、PSD含量、p-AKt蛋白表达水平随着芪参还五胶囊剂量的升高而升高，IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA水平、细胞凋亡率、AKt蛋白表达水平随着芪参还五胶囊剂量的升高而降低。

综上所述，芪参还五胶囊可通过抑制PI3K/AKt信号通路而改善大鼠黑质纹状体氧化还原反应，缓解炎症反应，降低细胞活力和侵袭，促进凋亡，保护神经元突触结构完整性及良好的超微结构基础。