基于传统煎药工艺的锦灯笼饮片标准汤剂质量研究

邢海燕，李晓亮，张洁，李成网

（1.合肥市第二人民医院（安徽医科大学附属合肥医院），安徽 合肥 230012；2.安徽九方制药有限公司，安徽 亳州 236800；3.安徽省医学科学研究院，安徽 合肥 230061）

锦灯笼是茄科植物酸浆Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino的干燥宿萼或者带果实的宿萼。苦，寒，归肺经，具有清热解毒、化痰利咽、利尿通淋的功效［1］。锦灯笼主要含有甾体类、甾醇类、生物碱类、氨基酸类及其他类型化合物［2-4］。研究表明锦灯笼具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、利尿、免疫调节、镇痛等药理活性，作为一种清热、解毒药被广泛应用于临床［5-8］。

中药配方颗粒既符合中医辨证论治，又具有免煎煮、起效快、携带方便、安全卫生等特点而被临床越来越广泛使用［7-9］。同时也存在着质量标准不高，临床有效性和合理性尚需要进一步验证等问题［9-11］。国家药品监督管理局于2021年发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，明确提出了标准汤剂的概念。标准汤剂［12］是指以传统中医药理论作为指导，选取主产区药材或道地药材，经加工炮制而成合格饮片后，按照临床应用时传统汤剂的煎煮方法，参照现代中药提取方法制备而成的单味中药饮片水煎剂。将“标准汤剂”作为中药配方颗粒的标准参照物，来衡量与临床汤剂是否基本一致，目前尚未有锦灯笼标准汤剂的质量评价方法的相关文献报道。

以市售5个主产地15批锦灯笼饮片为材料，遵循标准汤剂制备方法，用标准化工艺制备标准汤剂，并以木犀草苷为指标成分，考察其在标准汤剂中的含量，计算转移率、出膏率，并建立了标准汤剂的指纹图谱，为建立锦灯笼饮片标准汤剂的质量标准提供数据支撑。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate3000高效液相色谱仪（Thermo公司），配 置LPG-3400A四 元 泵、DAD检 测 器、WPS-3000TSL自动进样器、TCC-3000SD柱温箱；QUINTIX125D型电子天平（德国SARTORIUS公司），ATX124电子分析天平（SHIMADZU公司）；LC-12N-100B真空冷冻干燥机（南京鑫之曼叶设备有限公司）；RE5002型减压旋转蒸发器（江苏省常州恩培仪器有限公司）；KM-615B超声清洗机（江苏省常州市科盟仪器仪表有限公司）。

1.2 试药

木犀草苷（批号：111720-201810；纯度：93.5%）、木犀草素（批号：111520-201605；纯度：99.6%）购自中国食品药品检定研究院；酸浆苦味素A（批号：180301-025；纯度：98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇色谱纯（MERCK化学试剂公司）、其他试剂均为分析纯，水为超纯水。15批5个不同产地锦灯笼药材均由亳州广源堂中药饮片有限公司提供。药材详细信息见表1。

表1 药材来源信息Table 1 The sources information sheet of Physalis Calyxseuf Ructus

2 方法与结果

2.1 锦灯笼饮片的检测

按照2020年版《中国药典》“锦灯笼”饮片项下有关规定进行检测［1］，15批锦灯笼饮片的性状、鉴别及含量等均符合药典规定，其中含水量为6.1%～7.8%、木犀草苷含量为0.12%～0.35%。

2.2 基源鉴定

经安徽中医药大学生药学系刘守金教授鉴别，15批锦灯笼基源均为茄科植物酸浆Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino的 干 燥宿萼或带果实的宿萼，基源符合2020年版《中国药典》规定。

2.3 标准汤剂的制备[11]

称取各批次锦灯笼饮片100 g，分别加12倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火保持微沸30 min，200目筛网过滤；药渣再加10倍量水煎煮25 min，合并2次滤液，经50℃减压浓缩至150 mL的流浸膏，于冰柜冷冻（-40℃）后，再放入冷冻干燥机中干燥，得标准汤剂冻干粉，测定其水分、出膏率。水分按照《中国药典》2020年版四部通则0832项下第二法测定，计算：出膏率=［标准汤剂冻干粉/饮片质量］×100%，结果见表2。

表2 锦灯笼标准汤剂冻干粉水分、出膏率的考察Table 2 The moisture，extractum rate of freeze-dried powder Physalis Calyxseuf Ructus standard decoction

2.4 锦灯笼标准汤剂中木犀草苷含量研究

2.4.1 对照品溶液的制备精密称取木犀草苷对照品，加甲醇配制成含木犀草苷20 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2 供试品溶液的制备精密称取各批次锦灯笼标准汤剂冻干粉约0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）60 min，放冷后再称定质量，用70%甲醇补足失去的质量，摇匀，滤过，即得。

2.4.3 色谱条件色谱柱：phenosphere luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸（20∶80）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：350 nm；进样量：20 μL；理论板数按木犀草苷峰计算应不低于3 000。色谱图见图1。

图1 含量测定试验中的高效液相色谱图Figure1 HPLC chromatograms in content determination test

2.4.4 线性关系考察精密称取适量木犀草苷对照品，加70%甲醇分别制成每1 mL约含6、12、24、48、96 μg的对照品溶液，吸取上述溶液各20 μL，按“2.4.3”项下色谱条件测定峰面积，以木犀草苷浓度（μg/mL）为横坐标（X），350 nm波长下峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算标准曲线回归方程为Y=0.951X+1.0267，R2=0.999 9。

2.4.5 精密度考察取锦灯笼标准汤剂供试品溶液（批号：2006001Y），按照“2.4.3”项下色谱条件连续进样6次，测定木犀草苷峰面积的RSD为0.17%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性考察取锦灯笼标准汤剂的供试品溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算木犀草苷峰面积的RSD为0.47%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.4.7 重复性考察取同一批锦灯笼标准汤剂冻干粉，平行制备6份锦灯笼标准汤剂供试品溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件进样，计算供试品溶液中木犀草苷含量RSD为0.13%，表明本方法的重复性良好。

2.4.8 加样回收率考察精密称取已知含量锦灯笼标准汤剂6份，分别精密加入等量木犀草苷对照品，按“2.4.3”项下色谱条件进样，测定并计算木犀草苷的加样回收率为103.7%，RSD值为2.0%。

2.4.9 样品测定按照“2.4.3”项下色谱条件，测定15批锦灯笼标准汤剂、饮片中木犀草苷含量，按照W×X/M×100%计算木犀草苷的转移率，其中，W为标准汤剂中木犀草苷的含量，X为饮片出膏率，M为饮片中木犀草苷的含量。见表3。

表3 锦灯笼标准汤剂和药材木犀草苷含量及转移率Table 3 The luteoloside content and transfer rate of Physalis Calyxseuf Ructus standard decoction

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 色谱条件phenosipherelunaC18色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）、0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱条件详见表4，流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25℃；进样量：20 μL；色谱图见图2。

图2 指纹图谱试验中的对照品、供试品溶液色谱图Figure 2 HPLC chromatograms in fingerprint spectrum test

表4 梯度洗脱条件Table 4 Gradient elution program

经查阅文献并与对照品色谱图比对后，指认出2、4、6号峰分别为木犀草苷、木犀草素、酸浆苦味素A。木犀草苷为含量测定指标成分，且其含量高、稳定，故选择2号峰为参照峰（S），以此计算标准汤剂中主要特征峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD值。

2.5.2 对照品溶液制备精密称取木犀草苷、木犀草素及酸浆苦味素A对照品适量，加70%甲醇配制成浓度分别为50、70、50 μg/mL的溶液，即得。

2.5.3 供试品溶液的制备精密称取各批次锦灯笼标准汤剂冻干粉末约0.2 g，分别置25 mL容量瓶中，加70%甲醇超声溶解60 min，放冷后定容，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.5.4 精密度试验取锦灯笼标准汤剂供试品溶液（批号：2006001Y），按照“2.5.1”项下色谱条件连续进样6次，以木犀草苷峰为参照（S峰），计算10个共有峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD值，结果均小于2%（n=6），表明本法精密度良好。

2.5.5 稳定性试验取锦灯笼标准汤剂供试品溶液（批号：2006001Y），分别于0、3、6、9、12、15、24 h注入液相色谱仪，记录10个共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各共有峰的相对峰面积和相对保留时间RSD值分别为0.02%～0.10%和0.41%～1.71%，均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.6 重复性试验取锦灯笼标准汤剂（批号：2006001Y）粉末，研细，按“2.5.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，记录10个共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.04%～0.08%和1.21%～1.98%，均小于2%，表明该方法重复性良好。

2.5.7 指纹图谱的建立取15批锦灯笼饮片标准汤剂冻干粉各适量，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，同时按“2.5.1”项下色谱条件进样，依法测定，采用国家药典委员会公布发行的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）软件”，对色谱图进行整体相似度评价，得到指纹图谱（图3）；该软件通过均值法和中位数法，合成具有代表性的指纹图谱作为对照图谱，采用夹角余弦法计算样品指纹图谱与对照图谱之间的夹角余弦相似度作为评价指标，相似度在0.9～1.0之间视为符合要求，结果见表5。确定了10个共有峰，15批标准汤剂相似度均大于0.9，表明各批锦灯笼标准汤剂具有良好的特征性及稳定性，符合指纹图谱相似度要求。

表5 15批锦灯笼标准汤剂相似度评价结果Table 5 Similarity evaluation of 15 batches of standard decotion of Physalis Calyxseuf Ructus

图3 15批锦灯笼标准汤剂HPLC指纹图谱Figure 3 HPLC fingerprint spectrum of 15 batches of standard decotion of Physalis Calyxseuf Ructus

3 讨论

本研究依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》及《医疗机构中药煎药室管理规范》，基于传统煎药工艺，利用现代生产提取设备制备锦灯笼饮片标准汤剂，并对其进行质量标准研究。按照《中国药典》2020年版的方法，选取木犀草苷为锦灯笼标准汤剂的指标成分。15批不同产地的饮片中木犀草苷含量存在一定差异（范围：0.13%～0.35%），含量波动范围较宽泛，真实反映出锦灯笼饮片市场的情况。15批标准汤剂出膏率范围在16.0%～24.1%之间，平均出膏率为21.2%，RSD为1.91%，表明本实验的制备工艺成熟、稳定可靠。

木犀草苷为锦灯笼的主要有效成分，可溶于热水、热甲醇、乙醇、乙腈等溶剂，微溶于水；参照2020年版《中国药典》“锦灯笼”项下方法［1］，采用HPLC测定锦灯笼标准汤剂中木犀草苷的含量来进行质量控制，并进行了方法学考察，结果表明：该方法针对性强、效果良好；在标准汤剂制备的过程中，锦灯笼中木犀草苷的平均转移率为42.8%，转移率范围约为±10.0%［12-13］。

锦灯笼中除含有木犀草苷成分外，还含有有机酸类等其他成分，如仅以木犀草苷作为本品质量评价指标，就不能完整地反映锦灯笼化学组分特征。指纹图谱能够全面地体现中药质量，是目前控制中药质量的公认评价模式［14-17］。本实验采用HPLC法，建立了锦灯笼标准汤剂的指纹图谱，方法学考察结果表明此方法准确度高、重复性良好。指纹图谱的建立克服了单一成分木犀草苷信息量不足的缺陷，可更加全面控制锦灯笼标准汤剂的质量。本研究为锦灯笼配方颗粒的生产、质量控制及评价，提供了切实可行的试验数据依据。