猪布鲁氏菌病流行病学调查及3种检测方法比较

方来杉 李莎莎 黄文华 王宝珍 南平市延平区农业农村局 福建 南平 353000

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属的布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人畜共患传染性疫病[1]。是OIE规定必须报告的B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。目前发现布鲁氏菌易感动物有60多种，包括禽类、哺乳类和人类。其中牛、猪、羊是畜间布鲁氏菌的主要传染源，啮齿动物如鼠、野兔和豚鼠也能携带布鲁氏菌，是养殖场不可忽视的传染源。目前发现的猪布鲁氏菌（Brucella Suis）有5个生物型，其中1、2、3型可以引起猪发病，4、5生物型可引起其他动物发病[2]。由于不同种的布鲁氏菌具有宿主转移特性，羊种、牛种布鲁氏菌亦可引起公猪睾丸炎、附睾炎和关节炎，母猪流产、死胎和不孕等症状。猪群主要经呼吸道、生殖道及破损皮肤、黏膜感染猪布鲁氏菌病，20周龄以下猪只具有一定的抵抗能力，随着日龄增大，感染该病的风险更大[3]。

常用的布鲁氏菌病诊断方法有三种：血清学方法、细菌学方法和分子生物学方法，血清学方法与后两者相比，操作简便、成本低廉、便于大批量临床样品监测。血清学方法包括虎红平板凝集试验（RBPT）、荧光偏振试验（FPA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、试管凝集试验 （SAT）、补体结合试验（CFT）和胶体金等。2018年9月已实施的《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T18646-2018）将iELISA和cELISA纳入了国家标准，cELISA可以区分疫苗接种和野毒株感染。

本研究通过血清学诊断方法了解延平区规模猪场猪布病抗体阳性率情况，为了确保布病检测结果准确，减少漏诊、误诊情况，同时对3种布病血清学检测方法进行比对试验。本研究目的是通过准确的检测结果与分析，进而掌握延平区猪布鲁氏菌病的发病情况，为该病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液来源2022年4～5月从延平区12个乡镇各随机选择1个规模化猪场，每个猪场各采集30份血清样品，共采集360份样本，12家猪场均未免疫猪布鲁氏菌病疫苗。

1.1.2 试剂仪器 虎红平板凝集试验：虎红平板凝集抗原（哈尔滨维科生物技术有限公司，批号2022001）、受检阴性血清、布鲁氏菌标准阳性血清、玻璃平板。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测试剂盒（浙江迪恩生物科技有限公司，批号82011）、布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试剂盒 （北京中海生物科技有限公司，批号20220401/1）、50 μL可调移液器、一次性移液器枪头等。

1.2 方法

1.2.1 虎红平板凝集试验 参考《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646-2018)的方法，具体如下：将被检血清0.03 mL与抗原0.03 mL相混合，4 min内观察结果。

1.2.2 酶联免疫吸附试验iELISA和cELISA试验均按各自试剂盒的使用说明书进行操作。

2 结 果

2.1 虎红平板凝集试验初筛结果 从图1可知，虎红平板凝集反应中标准阴性血清样本（B4）无凝集现象，液体均匀浑浊。标准阳性血清（C4）、A1、B1和B2样品呈现有明显的凝集颗粒，A3、A4、C1和C3样品可见有较明显的凝集颗粒，液体稍透明。A2、B3和C2样品液体均匀浑浊，无凝集现象。

图1 部分虎红平板凝集试验结果

由表1可知，12个乡镇的12家规模场的虎红平板凝集试验共检出阳性血清样本54份，抗体阳性率为15%，其中C乡镇的猪布病抗体阳性率为13.33%；D乡镇的猪布病抗体阳性率高达100%；G乡镇的猪布病抗体阳性率为66.67%。

表1 规模猪场布病虎红平板凝集试验结果

2.2 间接ELISA和竞争ELISA试验结果 将虎红平板凝集试验初筛出的54份抗体阳性血清样本，再次进行虎红平板凝集试验，同时也将54份抗体阳性血清样本进行间接ELISA和竞争ELISA复核试验。由表2可知，初筛得到的54份抗体阳性血清样本的RBPT抗体阳性率为100%，可排除因玻璃平板污染的因素。然而间接ELISA和竞争ELISA试验均无抗体阳性血清样本检出。RBPT容易受待检血清质量、反应温度、试验人员主观因素等影响，而ELISA作为我国现行国标推荐方法，特异性强。在临床监测猪布鲁氏菌病工作中，必须使用多种布病检测方式方能确保检测结果的可靠性。

表2 三种血清学检测方法的比较

3 分析与讨论

本次试验结果显示，南平市延平区12家规模猪场尚无猪布鲁氏菌病。虽然本地区未发现有猪布鲁氏菌病，但本地区为福建省畜牧养殖大县（区），拥有95家左右大中小型养猪场、14家规模化乳牛场、总存栏量约1万多头以及众多零星散养的养羊户，各乡镇的猪场处于较为复杂的养殖环境，做好猪布鲁氏菌病的监测调查工作不容松懈。布鲁氏菌病影响人和家畜动物的健康，进而对养殖业和人类公共卫生造成巨大的安全隐患。

本次试验数据显示，RBPT法与iELISA、cELISA相比出现了较高的假阳性，特异性较低。其中D、G两乡镇假阳性率分别为100%、66.67%。RBPT法有较高的误诊率，主要原因如下：一是，抗凝剂对RBPT有显著影响，在乳酸缓冲液下血浆中的纤维蛋白原会与虎红试剂（四氯四碘荧光素）发生非特异性凝集反应，造成极高的假阳性率[4]，因此，不可用血浆进行布鲁杆菌病RBPT检测；二是，反应温度对RBPT的影响，RBPT所用的抗原需要恢复至室温，血清放置回温时间越短、温度越低，假阳性率越高；三是，血清的药物浓度、试验人员操作的规范性、严谨性等均在一定程度影响试验的准确性。

在临床监测猪布鲁氏菌病工作中，必须使用多种布病检测方式，尽量减少漏诊、误诊情况的出现。同时，加强基层兽医人员的采血技术培训，按照要求采集血清样本，不可用血浆代替血清。布病是人畜共患病，目前主要防治措施是采取检疫净化，检测结果真实可靠对于防治该病具有至关重要的作用。