气质联用(GC-MS)内标法测定烟叶中烟碱的含量

马 骏，陈发元，孙智荣，王茂胜，黄 鸿，夏志林，郭亚利

(1.贵州省烟草公司黔西南州公司技术中心，贵州 兴义 562400；2.贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州 贵阳 550003；3.中低品位磷矿及其共伴生资源高效利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550016)

0 引言

烟碱(尼古丁)作为烟草生物碱的主要成分，在烟叶中含量占1%～3%，是烟叶总生物碱的90%～95%。烟叶中的大部分烟碱能与有机酸结合形成有机盐，只有一小部分以游离形态存在。烟碱的含量是衡量烟叶质量的重要因素。影响烟碱含量的主要因素有烟草品种[1]、施肥[2-5]、栽培密度[6-7]、打顶抹杈[8-9]、土壤含水率[10]、生长调节剂[11]、调制技术、生态条件[12]等。目前，烟碱含量的测定方法采用光谱法[13-15]、色谱法[16-18]、两谱联用法[19]等。烟碱含量测定方法较多，各有优缺点。本文采用气相色谱与质谱联用，内标法进行烟叶中烟碱的定量测定，并对方法进行验证，为烟叶烟碱含量测定提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

氦气(纯度≥99.999%)；烟碱(标样，纯度95.0%，国家标准物质资源平台)；正十七烷标准品(内标，纯度99.4%，国家标准物质资源平台)；烟叶样品(由黔西南州七舍烟叶站提供)。气相色谱-质谱联用仪7890A-5975C；DENVER 电子天平(感量0.1/0.01 mg)；SB-100T 超声波振荡器。

1.2 方法

1.2.1 萃取溶液配制

配制0.05%(g/mL)正十七烷的正己烷溶液1 000 mL。

1.2.2 烟碱标准溶液配制

配制烟碱标准溶液使其浓度为1.892 mg/mL，分别准确吸取烟碱标准液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 于25 mL 棕色容量瓶中，用1.2.1的萃取溶液定容至刻度，得到烟碱浓度分别为37.84，75.68，113.50，151.20，189.00 μg/mL 的标准溶液系列。

1.2.3 色谱条件

色谱条件如表1所示。

表1 色谱条件

1.2.4 标准曲线绘制

按照1.2.3的色谱条件，分别测定不同浓度烟碱标准溶液，建立标准曲线方程。横坐标为标准烟碱溶液的浓度，纵坐标为烟碱峰面积与内标物峰面积的比值。

1.2.5 样品制备

准确称量2 g烟叶3份，精密称定，分别放入100 mL锥形瓶中，然后分别加入水20 mL，萃取溶液40 mL和氢氧化钠溶液10 mL，超声萃取30 min，静置后取上层有机相用于分析测定。

1.2.6 精密度测定

取151.2 μg/mL的烟碱标准溶液，按照1.2.3的色谱条件连续进样6 次，用样品的烟碱含量的相对标准偏差考察仪器精密度。

1.2.7 加标回收率测定

采用标准加入法测定所建方法的回收率。首先，准确称取烟叶样品10份(烟碱含量已知)，分别置于100 mL锥形瓶中，再分别准确加入1 mg/mL烟碱标准溶液0.5，1.0，1.5 mL各3份。按1.2.5方法对加标样品进行测定，并根据样品烟碱含量、加入量和测得量，计算烟碱的加标回收率。

1.2.8 稳定性测定

将同一烟叶样品溶液在室温下，存放0，6，12，24 h 后在相同条件下进行测定，根据相对标准偏差衡量其稳定性。

1.2.9 样品含量计算

样品中烟碱的含量以mg/g 计，结果以平均值表示(测定3次)。

2 结果分析

2.1 选择离子的选取

将烟碱标准溶液和内标物的混合溶液按1.2.3中测定条件进行分析，采用选择离子扫描(SIM)方式，质量扫描范围33～550 amu。内标物(正十七烷)保留时间为9.64 min，烟碱保留时间为12.68 min。选取相对丰度较高的2个离子为定量选择离子，定量离子m/z分别为84.10和133.00。样品的烟碱含量在选择离子扫描(SIM)方式下，烟碱标准溶液的总离子流色谱图如图1所示，样品提取液的总离子流色谱图如图2所示。

由图1和图2可知，烟碱与内标物色谱峰分离良好，谱图纯净，可以进行定量分析。

2.2 标准曲线的绘制

烟碱标准溶液回归曲线方程为y= 0.001x+ 0.001 6，相关系数r= 0.999，如图3所示。说明烟碱在37.84～189.00 μg/mL 浓度范围内线性良好。

2.3 精密度测定结果

将同一烟叶样品溶液在相同条件下平行测定6次。样品的烟碱含量测定结果分别为23.41，23.41，23.89，23.10，23.71，23.46，23.61 mg/g，相对标准偏差(RSD)为 1.16%，表明该方法的精密度高，能够满足测定要求。

2.4 稳定性

将同一烟叶样品溶液在室温下分别保存0，6，12，24 h，然后在相同条件下进行测定，烟碱含量结果为23.46，23.81，23.40，23.12 mg/g，相对标准偏差(RSD)为1.20 %，表明待测样品液在24 h 内比较稳定。

2.5 加标回收率

在1.2.3色谱条件下进样计算结果如表2所示。由结果可知，其回收率在96%～103%的范围内，证明测量方法准确度高。

表2 加标回收率结果

2.6 样品烟碱含量测定结果

样品烟碱含量测定结果如表3所示。

表3 烟叶样品测定结果

3 结语

建立了内标标准曲线联用气相色谱-质谱法测定烟叶中烟碱含量的方法。与文献中的方法相比，该方法能有效地避免复杂样品中其他非目标物质的干扰，无干扰色谱峰。试验结果表明，该方法具有灵敏度高、简单、快速、准确、可靠等特点，适用于烟叶中烟碱的含量测定。