AKT/mTOR信号通路调控miR-623表达对膀胱尿路上皮癌细胞侵袭和迁移的影响

王官峰 马锋 陈如

膀胱癌是常见的泌尿道恶性肿瘤，是发达国家第五种最常见的恶性肿瘤[1]。膀胱癌的病因较为复杂，涉及遗传和环境因素。当肿瘤进展为侵袭性是复发率高且临床预后差,膀胱癌的早期诊断和治疗对于提高预后非常重要[2]。迄今为止许多研究报道了预测膀胱癌风险和复发的分子标记物，但膀胱癌发生发展的确切机制尚未阐明[3]。蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)与细胞增殖、细胞周期进展以及细胞凋亡等多种细胞密切相关[4]。AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路是膀胱癌治疗的重要靶点，mTOR特异性抑制剂，雷帕霉素在膀胱癌中的作用以及膀胱癌中期下游分子通路的改变被广泛研究[5]。微小核糖核酸-623(microribonucleic acid-623，miR-623)是一种新发现的miRNA，有报道miR-623在胃癌、胰腺癌和肺癌中发挥抑制癌因子的作用，能够抑制细胞生长和肿瘤进展,然而miR-623在膀胱癌中的作用尚不清楚[6]。本文旨在研究基于AKT/mTOR信号通路研究调控miR-623表达对膀胱尿路上皮癌细胞侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞 膀胱尿路上皮癌细胞株T24细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养膀胱癌细胞T24，并置于37℃、5%CO2恒温培养箱。

1.2.2 细胞转染及分组：采用LipofectamineTM200脂质体法将miR-623上调、miR-623下调转染至人膀胱T24细胞，及miR-623上调、miR-623下调，以仅加入LipofectamineTM200而未转染miR-623为膀胱癌组。等量接种T24细胞于6孔板中过液培养T24细胞贴壁生长至80%～90%融合度，miR-623上调组和miR-623下调组用终浓度为50 nmol/L的miR-623上调、miR-623下调转染的完全培养基培养约24 h左右。

1.2.3 HE染色:采集3组细胞标本液置于试管内，低温、3 000 r/min(半径∶12 cm)离心10 min，分离上清液，-80℃超低温冰箱内保存待检。然后将3组细胞标本提取液置于4%多聚甲醛中浸泡固定，24 h后脱水处理，石蜡包埋，切成4 μm切片，依次经二甲苯、梯度乙醇水化后，苏木精浸染5 min，盐酸乙醇分色，自来水冲洗，1%伊红染色2～3 min，脱水、透明、封片，光镜进行观察。

1.2.4 miR-623的表达检测:采用实时荧光定量PCR检测miR-623的表达：将采集到的100 μl细胞标本加300 μl Trizol震荡混匀静置10 min，加80 μl氯仿再次震荡混匀静置5 min，离心后凝胶灵心至管底，加100 μl DEPC水。将标本混合液1 500 μl，离心处理15 min。提取上清液转移到含糖原EP管中，加等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃静置2 h。提取白色沉淀加1 ml 75%乙醇，混匀后充分洗涤RNA沉淀，4℃ 7 500 g，离心处理5 min，摒弃上清液。加80 μl DEPC水对RNA沉淀进行溶解，-80℃保存。采用逆转录试剂盒(TaqMan®miRNA Reverse Transcription Kit)逆转cDNA。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，采用2-ΔΔCT法对miR-623表达水平分析。

1.2.5 细胞迁移能力检测：取对数生长期的T24细胞，收集转染后3组细胞并将其铺种在6孔板上，待细胞生长至70%左右，用200 μl枪头垂直与孔板和线制造细胞划痕，尽量保证划痕宽度一致，PBS洗涤3次以去除漂浮的细胞，再加入无血清培养基。于划痕后24 h、48 h、72 h拍照。使用Image Pro Plus软件进行分析，测量细胞迁移的距离。

1.2.6 细胞侵袭能力检测：将Ma-trigel胶与RPMI-1640培养以1∶4体积比混合铺于Transwell侵袭小室，于上室加经过不同接种的200 μl细胞悬液，下室加700 μl含30%的胎牛血清培养基，置于恒温培养箱内继续培养12～24 h。用脱脂棉小心拭去基质胶及上室内细胞；以多聚甲醛固定10 min，1%结晶紫染色5 min，PBS洗涤3～5次，晾干，倒置显微镜下统计侵入下室的细胞数目。

1.2.7 AKT、mTOR基因相对表达检测:采用实时荧光定量PCR检测(杭州晶格科学仪器有限公司)AKT、mTOR，检测步骤同1.2.3。

1.2.8 细胞相关蛋白表达检测:采用免疫印迹(Western blot)将采集到的细胞标本提取液，通过 1 000 r/min离心处理后提取沉淀，滴加裂解液、反复冻融后，120 000 r/min离心处理，提取上清液，采用酶标仪检测p-AKT、p-mTOR蛋白浓度，保存。滴加10%的分离胶，封闭，吸干水分，给予5%的浓缩胶灌注，凝固后，将其在电泳槽中固定，加5 μl Marker、变性蛋白样品，电泳干预30 min，待蛋白分离胶底，结束电泳；转膜成功后将硝酸纤维素膜(Nitrocellulosefilter membrane，NC)膜在5%的脱脂奶粉中封闭固定1 h，加一抗(p-AKT、p-mTOR 1∶1 000)孵育，经过震荡洗膜后加二抗(p-AKT、p-mTOR 1∶10 000)，孵育，再次震荡洗膜，使用红外荧光成像系统对结果给予分析。以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 3组miR-623的表达 miR-623上调组表达低于膀胱癌组、miR-623下调组；miR-623下调组表达低于膀胱癌组，高于miR-623上调组(P<0.05)。见表1。

表1 3组miR-623的表达

2.2 3组细胞72h迁移结果比较 膀胱癌组的细胞迁移距离为(18.22±0.89)mm，而miR-623上调组为(27.17±0.92)mm，miR-623下调组为(19.77±0.40)mm。miR-623上调组细胞迁移距离高于膀胱癌组、miR-623下调组细胞迁移距离，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

膀胱癌组miR-623下调组miR-623上调组

2.3 3组细胞72 h侵袭结果比较 膀胱癌组细胞侵袭数(118.02±4.00)个，而miR-623上调组细胞侵袭数(70.30±2.36)个，miR-623下调组细胞侵袭数(105.00±3.51)个，miR-623上调组细胞侵袭数量低于膀胱癌组、miR-623上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

膀胱癌组miR-623下调组miR-623上调组

2.4 3组AKT、mTOR基因相对表达量 miR-623上调组AKT、mTOR表达低于膀胱癌组、miR-623下调组(P<0.05)；miR-623下调组AKT、mTOR表达高于miR-623上调组低于膀胱癌组(P<0.05)。见表2。

表2 3组AKT、mTOR基因相对表达量

2.5 3组蛋白相对表达量 miR-623上调组p-AKT、p-mTOR表达低于膀胱癌组、miR-623下调组(P<0.05)；miR-623下调组p-AKT、p-mTOR表达高于miR-623上调组，低于膀胱癌组(P<0.05)。见表3，图3。

表3 3组蛋白相对表达量

图3 3组相关蛋白表达比较(Western blot)

3 讨论

膀胱肿瘤是一个多步骤、多因素的渐进过程，受到系列基因的调控，引起众多生物学过程的发生[7]。研究表明，miRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展和侵袭和迁移密切相关，成为近年研究热点[8]。有研究发现miR-623能够抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭，成为预防膀胱癌的新型辅助治疗靶点[9]。

AKT/mTOR信号传导通路在肿瘤发展中的作用主要抑制细胞凋亡、促进细胞生存、调节细胞周期，促进肿瘤新生血管的形成以及侵袭与迁移。而近年来研究发现此信号通路与膀胱癌的关系非常密切[10]。通过miR-623抑制AKT/mTOR信号通路的活性，调节细胞物质代谢与细胞侵袭和迁移，实现肿瘤抑制[11]。有研究发现mRNA表达率明显低于表浅性癌，提示miR-623表达升高与膀胱癌的侵袭和迁移有关，miR-623可以通过调节AKT/mTOR信号通路，形象肿瘤细胞的侵袭转移[12]。有研究发现膀胱癌中AKT和mTOR蛋白的相互作用促进了肿瘤的发生，且p-AKT、p-mTOR的表达与膀胱癌的发生有密切关系，AKT的活化可以组织膀胱癌T24细胞的侵袭和迁移[13]。本研究结果证实miR-623参与膀胱癌发生的过程。

本研究显示，miR-623下调组T24细胞迁移能力提高，细胞侵袭能力降低。提示膀胱癌miR-623水平升高，说明miR-623参与膀胱癌发生的过程。有研究发现，miR-623在膀胱癌的侵袭和迁移中发挥重要作用，且在肾癌、胃癌结肠癌和肺小细胞癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用，参与肿瘤的侵袭和迁移[14]。另有研究发现，下调miR-623后膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力受到抑制[15]。上调miR-623膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力得到恢复，说明通过调节miR-623的表达可以影响膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力[16]。

AKT激活可抑制细胞侵袭和迁移促进肿瘤细胞生存，有报道AKT组成性的激活抑制T24介导的侵袭，在膀胱尿路上皮癌细胞株中，AKT过表达使细胞凋亡侵袭，AKT表达降低可抑制细胞的侵袭凋亡的作用[17]。mTOR于20世纪90年代早期在研究Rapamycin(大环内酯类亦被称为sirolimus)的作用机制时发现mTOR信号通路组成及作用机制十分复杂[18]。AKT/mTOR信号传导通路是2个关键激酶，在许多肿瘤中异常激活，并因此成为最常被选中的调控目标，但在膀胱癌中是否存在AKT蛋白激酶异常激活目前研究并不多[19]。有研究显示，细胞侵袭和迁移及周期等生物功能通过细胞内各种信号通路调节，AKT/mTOR是重要的信号传导通路之一，其异常激活与肿瘤的发生发展密切相关[20]。有学者研究显示，AKT/mTOR信号通路在乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中AKT/mTOR通路活化能够抵抗化疗、放疗引发的细胞凋亡、迁移[21]。相反选择性抑制AKT、mTOR活性，降低AKT、mTOR水平，使细胞对化疗、放疗所导致的凋亡迁移的敏感性增加[22]。

综上所述，miR-623在膀胱癌组织中显著，上调其表达可抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移，作用机制与AKT/mTOR信号通路相关。