柑橘皮中低极性PMFs提取工艺的初步探究

赵 莎

（西安培华学院，陕西西安 710065）

柑橘为芸香科柑橘属植物，主要含有两大类黄酮类成分，一类为黄酮苷类，主要为二氢黄酮类成分，如橙皮苷等；另一类是多甲氧基黄酮类，主要有川陈皮素、橘皮素等[1]。多甲氧基黄酮（Polymethoxyflavonoids，PMFs）多存在于柑橘类水果中，因其含有甲氧基数大于或等于4且极性较低而命名。PMFs因含有多种羟基、多甲氧基和糖苷而具有广泛的生物活性[2]。目前，离体实验及活体实验研究均表明多甲氧基黄酮几乎无毒性，脂溶性好、机体利用率高，能较好地改善人体健康。其中含量较高的PMFs是橘皮素和川陈皮素，具有降胆固醇、抗炎、抗癌、抗氧化、抗诱变和抗动脉粥样硬化等 作用[3]。

我国柑橘类水果产量非常丰富，一般以鲜食为主，少部分加工成罐头等商品。作为柑橘类水果加工的副产物，每年会产生1 600多万t柑橘类果皮，其中95%被废弃，从而引起环境污染和浪费资源等社会问题[4]。PMFs在柑橘类果皮中的含量较高，极具提取和利用价值，因其具有抗肿瘤、抗炎等生物活性而受到重视[5-6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘鲜果（采购于西安市朱雀批发市场）取果皮干燥后粉碎。川陈皮素，纯度＞98%；桔皮素，纯度＞98%；乙醇、吡啶、石油醚、甲醇，分析纯；乙腈，色谱纯。以上试剂均采购于西安润德生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Mettler Toleddo AB135-S电子天平（其林贝尔仪器有限公司）、KQ-250B数控超声波清洗器（上海森信仪器有限公司）、100 mL离心管（西安润德生物技术有限公司）、TD25-WS低速离心机（其林贝尔仪器有限公司）、E-201C型旋转蒸发器（上海申安医疗器械厂）、DZF-6090D 真空干燥箱（上海申安医疗器械厂）、LC-10AT 型高效液相分析仪（上海同田生物技术股份有限公司）、高速组织捣碎机（上海申安医疗器械厂）和LM61-350033 型恒温水浴锅（国华电器公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

称取5 g柑橘皮利用真空干燥箱于50 ℃烘干，于电子天平称重，高速组织捣碎机粉碎后过筛待用。于100 mL离心管中加入称量好的1 g柑橘皮粉碎物，再加入乙醇-吡啶（90∶30）的混合溶液 30 mL，将制备好的试剂于90 ℃恒温水浴锅水浴1 h待用。取出试剂于超声仪提取30 min冷却至室温。将试剂置于低速离心机以4 000 r·min-1离心 3 min，取上清溶液，再使用超纯水将上清溶液定容至80 mL，利用微孔滤膜进行过滤处理后，采用高效液相色谱分析。

1.3.2 色谱实验设计

（1）色谱条件。色谱柱：Diamonsil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）；检测波长：283 nm；流速：1 mL·min-1。

（2）标准曲线的绘制。使用电子天平分别称取 5 mg川陈皮素标准品、桔皮素标准品，将标准品分别使用甲醇试剂结合超声辅助技术溶解于20 mL容量瓶中，再进行定容后配制成0.5 mg·mL-1标准溶液备用。移取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和 2.5 mL 5个梯度溶液于容量瓶中，利用甲醇定容得到标准溶液（50～250 μg·mL-1）过滤后经高效液相色谱分析，再进行柑橘皮PMFs含量的测定。

1.3.3 单因素实验设计

通过单因素实验探究在不同的实验条件下多甲氧基黄酮的提取率，探究PMFs的最佳提取工艺条件。

（1）料液比对提取率的影响。分别称取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40，吡啶比例20%，温度65 ℃，超声波辅助提取20 min，按1.3.1步骤测定PMFs含量，计算提取率。

（2）提取时间对提取率的影响。分别称取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶30，吡啶比例20%，温度65 ℃，进行超声辅助提取5 min、10 min、15 min、20 min和25 min，按1.3.1步骤测定PMFs含量，计算提取率。。

（3）提取温度对提取率的影响。分别称取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶30，吡啶比例为20%，分别在温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃的条件下超声波辅助提取20 min，按1.3.1步骤测定PMFs含量，计算提取率。

（4）吡啶比例对提取率的影响。分别称取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶30，温度65 ℃，吡啶分别为15%、25%、35%、45%和55%，超声波辅助提取20 min，按1.3.1步骤测定PMFs含量，计算提取率。。

1.3.4 正交实验设计

根据上述单因素实验结果，设计4因素3水平正交实验，确定最佳提取工艺条件。正交实验因素水平如表1所示。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与分析

2.1 料液比对提取效果的影响

如图1所示，在一定条件下，PMFs提取率随液料比的增加而不断增加，但在料液比为1∶35左右达到峰值后提取效果减弱。由此得出，料液比为1∶35时，提取效果最优。

图1 料液比对提取率的影响

2.2 提取时间对提取效果的影响

如图2所示，在一定条件下，PMFs提取率随提取时间的增加而不断增加，当超声提取时间达到 20 min时，溶剂的穿透力达到较高的水平，因此能够达到最高提取率。随着超声时间的增加，多甲氧基黄酮提取率会逐渐增加，但超过一定的范围，提取率却逐渐降低，发生这种情况的原因可能是黄酮类化合物不稳定。

图2 提取时间对提取率的影响

2.3 吡啶比例对提取效果的影响

如图3所示，在一定条件下，随着乙醇和吡啶混合溶剂中吡啶比例的上升，多甲氧基黄酮提取率先增加后减小。实验结果显示，在吡啶比例达到25%时，PMFs提取率最高。

图3 吡啶比例对提取率的影响

2.4 提取温度对提取效果的影响

如图4所示，在一定条件下，随着温度的升高，PMFs提取率逐渐增加，但提取温度超过70℃后提取率会逐渐减小。

图4 温度对提取率的影响

2.5 正交实验结果

基于单因素实验结果，选择为4个因素的3个水平进行正交实验设计。由表2可知，乙醇-吡啶溶剂结合超声波辅助提取PMFs的最优组合为A3B3C2D1，提取率的影响顺序为C＞A＞B＞D，即提取温度＞料液比＞吡啶比例＞提取时间，即料液比例为1∶40，吡啶比例为35%，温度为70 ℃，时间为15 min，在此条件下PMFs提取效果最好，提取率为2.880%。

表2 正交实验设计及结果

3 结论

本研究采用超声波辅助法提取低极性PMFs，选取乙醇和吡啶混合溶剂为提取溶剂，探究吡啶比例、料液比、提取温度和提取时间对PMFs提取效果的影响。正交实验确定了乙醇-吡啶溶剂结合超声波辅助提取PMFs的最优组合为A3B3C2D1，即料液比例为1∶40，吡啶比例为35%，温度为70 ℃，时间为 15 min，在此条件下PMFs提取效果最好。相对于索氏提取法的烦琐工艺，采用乙醇-吡啶溶剂超声浸提法具有可有效保留活性成分、操作简便、节省时间、效率高及重复性好等特点，有益于综合开发利用柑橘皮这一可再生资源[7]。本研究为探索简便、高效、经济的PMFs提取方法提供理论依据，在医药、食品领域等有重大的经济及社会效益。