鲜乳中抗生素残留微生物检测技术研究

胡燕玲，陈亚波

（中山市食品药品检验所，广东中山 528400）

鲜乳由于营养丰富被称为“白色血液”，是人们尤其是婴幼儿的主要营养品，对鲜乳安全问题影响最大的是抗生素残留。随着夏行昊[1]、李惠[2]、王宏博[3]和陶利明等[4]对牛奶及乳制品中抗生素残留危害相关问题的研究报道，近些年多个省市（浙江省、辽宁省、广州市、昆明市、贵阳市和乌鲁木齐市等）[5-10]对鲜乳及奶类食品中的抗生素残留进行检测，结果发现不同批次的奶类食品中均有检出抗生素残留阳性。鲜乳及其乳制品中抗生素残留问题日益受到关注。目前，鲜乳中抗生素残留的检测方法有仪器法[11-13]、免疫法[14-16]、和微生物学法[17-19]。这3种方法中，仪器法需要有大型仪器设备，并且检测程序复杂、检测费用较高；免疫法在检测过程中很容易受外界因素的影响，适合实验室样品量少的研究实验；微生物检测方法不需要大型仪器、操作简单和成本低廉，是目前实验室、牧场和企业中应用较广泛的方法[20]。

本文通过采用利普斯50（E50）试剂盒快速检测与国家标准GB/T 4789.27—2008[21]微生物法进行检测比对，建立起完善的鲜乳中抗生素残留检测技术。有利于加强广东省中山市乳制品的监管，杜绝有抗奶流入市场，保证乳及乳制品的质量安全，减少经济损失和人身伤害。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

利普斯50（E50）抗生素检测试剂盒、4% 2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基、青霉素G钾盐、磷酸盐缓冲液（PBS）等均购于北京陆桥；无抗生素的脱脂乳购于超市。

1.2 仪器与设备

HVA-85高压灭菌锅（日本Hirayama公司）；KB400生化培养箱[宾德亚太（香港）有限公司]；LSC-316C冰箱（浙江星星家电股份有限公司）；带盖恒温水浴锅；JY20002电子天平；10～100 μL微量移液器（德国普兰德公司）；QL-861旋涡混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；L400离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 标准菌株

嗜热链球菌（IFFI 6038）和嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种（GIM1.543）购自广东省微生物菌种储藏中心。

1.4 嗜热链球菌菌液的配制

挑取新鲜培养物嗜热链球菌接种无菌脱脂乳，按照GB/T 4789.27—2008[21]中第6.2条规定配制测试菌液。注意嗜热链球菌如果是超低温冰箱保存，要先肉汤复苏后划营养琼脂纯化确定活性后才能用于实验。

1.5 嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞悬液及测试培养基的配制

按照GB/T 4789.27—2008第12.1和12.2条规定配制嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞悬液及测试培养基的制备。配制过程中需要注意以下几点：嗜热脂肪芽胞杆菌需在营养琼脂平板上反复纯化两次，挑取新鲜培养的单个菌落划营养琼脂平板与（36±6）℃培养3～ 4 d；嗜热脂肪芽胞杆菌的芽胞要经镜检高达95%以上才能进行芽胞悬浮液的配制；测试培养基分装小管时，做好小管口密封防止水分蒸发；涉及标准菌株操作要遵循实验室生物安全制度，在二级生物实验室安全柜里操作。

1.6 加标检测乳液制备

在精确度为0.000 1 g天平上称取青霉素G钾盐标准品10.0 mg，先用适量无菌磷酸盐缓冲液溶解，再将该溶液用无菌的无抗生素的脱脂奶稀释，取含青霉素G钾盐标准品浓度为1 μg·mL-1，0.1 μg·mL-1，0.008 μg·mL-1，0.006 μg·mL-1，0.005 μg·mL-1， 0.004 μg·mL-1，0.003 μg·mL-1。

1.7 实验原理与检测

1.7.1 利普斯50（E50）抗生素检测试剂盒原理与检测

（1）原理。利普斯50的检测基于细菌生长抑制的原理。当微孔板放置于65 ℃恒温培养箱培养时，孢子萌发，细菌生长并代谢产生酸使得琼脂的酸碱度降低，从而导致琼脂中酸碱指示剂由蓝色（紫色）变为微黄色。如果待检的乳样品中含有高于检出限的抗生素残留，则微生物生长被抑制，琼脂中的颜色不发生变化。

（2）检测。取出实验所需要的微孔板，垂直撕开微孔板上保护箔膜，每孔加入50 μg·mL-1样品，每个样品做三孔平行检测，同时作阴性和阳性对照。用黏性胶膜封好板孔，放置于65 ℃恒温培养箱培养2.75 h。观察时从微孔侧面观察检测结果，以标准比色卡为参照，显蓝色为阳性，显黄色为阴性，非蓝非黄的为可疑结果，需进行复检。

1.7.2 嗜热链球菌抑制法（传统TTC法）原理与检测

（1）原理。按照GB/T 4789.27—2008第2条规定，待测试样品经过80 ℃杀菌后，加入预先制备的嗜热链球菌液。36 ℃培养2 h后，嗜热链球菌开始增长繁殖。加入代谢底物4% 2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液显色剂，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌继续增殖，反应还原TTC成为红色物质。反之，若样品中含有高于检测限的抑制剂，则嗜热链球菌生长受抑制，TTC不发生还原反应，样品保持原来颜色不变。

（2）检 测。按 照GB/T 4789.27—2008第6.3条的标准方法进行实验操作，并做阴阳性对照实验，同时注意加入测试液及TTC显色剂时要轻摇或涡旋15 s混匀，所有实验管放置在36 ℃水浴避光培养 30 min，立即观察其颜色变化。若颜色无变化，于水浴中继续避光培养30 min进行最终观察。观察时要快速，最好关灯观察，避免光照过久干扰。TTC指示剂配制一定要避光，实验过程中也要避光操作，尽量减少假阳性的结果。

结果观察与判读：在白色背景前观察，试管中样品呈乳的原色时，表示指示乳中有抗生素存在，结果为阳性。若试管中样品呈红色，则为阴性。如试管颜色变化无法判定，则为可疑结果，需重新检测。

1.7.3 嗜热脂肪芽胞菌抑制法原理与检测

（1）原理。培养基预先混合嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞，并含有pH指示剂（溴甲酚紫）。加入样品并孵育后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽胞将在培养基中生长并利用糖产酸，pH指示剂由紫色变为黄色。反之，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽胞不会生长，pH指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。

（2）检测。按照GB/T 4789.27—2008第12.3条的标准要求进行实验操作，注意同时做阴阳性对照实验，实验管置于（65±2）℃水浴培养2.5 h，观察培养基的变化。若实验管颜色没有变化，需在水浴中培养30 min再进行最终观察。

结果判读：在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色。培养基颜色为紫色判读为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色判读为阴性结果，颜色处于二者之间，则为可疑结果。出现可疑结果应继续培养30 min再进行最终观察。若培养基颜色仍然处于黄色和紫色之间，仍为可疑结果，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，需重新检测。

2 结果与分析

2.1 三种检测方法加标测试所取得的结果

利普斯50（E50）、嗜热链球菌抑制法（传统TTC法）和嗜热脂肪芽胞菌抑制法检测加标乳液抗生素残留的检测结果如表1所示。利普斯50（E50）、嗜热链球菌抑制法（传统TTC法）和嗜热脂肪芽胞菌抑制法在鲜乳中抗生素残留检测结果一致。

表1 3种检测方法加标测试所取得的结果比较

2.2 实际样品检测

通过从市面上随机购买61批牛奶样品，其中低温保存鲜牛奶10批，散装水牛奶4批，乳粉2批（按照奶粉说明用无菌水配制后进行检测），常温保存纯牛奶45批。分别采用利普斯50（E50）试剂盒、国标嗜热链球菌抑制法（传统TTC法）和嗜热脂肪芽胞菌抑制法进行检测，试验结果表明61批牛奶样品的抗生素残留检测结果均为阴性，说明市面上销售的牛奶及奶制品中抗生素残留是比较安全的。

3 结论

实验结果表明，采用利普斯50（E50）法得到的检测结果与国家标准GB/T 4789.27—2008中嗜热链球菌抑制法（传统TTC法）和嗜热脂肪芽胞菌抑制法一致。国家标准嗜热链球菌抑制法（传统TTC法）只适用于鲜乳检测，试管颜色变化很容易判读为假阳性；嗜热脂肪芽胞菌抑制法虽然适用于鲜乳、复原乳、消毒灭菌乳和乳粉中抗生素检测，但是实验前标准菌株的优质保存、活化、测试菌液制备、芽孢悬液制备及测试培养基制备等耗时长，对检验人员技术熟练度要求较高。利普斯50（E50）方法适合鲜乳及乳制品中抗生素残留的检测，其操作步骤简单方便，2.75 h出结果，检测量大，快速高效，一般检验员都能进行检验操作，可作为鲜乳中抗生素残留检测首选快速检测法，值得在奶牛养殖场、鲜乳制品企业和检验机构中推广应用。