超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中的 孔雀石绿含量

黎建樑，王若男，钟建权，卢婉婷

（广东省绿色产品认证检测中心有限公司，广东广州 510440）

孔雀石绿（Malachite Green，MG）是一种三芳基甲烷染料，分子式为C23H25ClN2，通过苯甲醛和二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌的存在下缩合而成的一种深绿色的结晶固体[1]。目前，水产品是人们高质量蛋白的主要来源之一，是个快速发展的食品生产产业，水产品的在养殖过程中容易受蠕虫和一些真菌的感染，影响鱼类的存活率[2]。1974年，研究人员发现孔雀石绿具有控制原生动物真菌感染的功能。后来，人们发现孔雀石绿应用在水产品中是一种很好的抗菌剂，能提高水产品的存活率，因此孔雀石绿曾被广泛应用在水产品中[1]。然而，孔雀石绿对人体和环境均会造成一定的危害。1983年，迈耶和乔根森等科学家研究发现，孔雀石绿对人体有基因毒性和致癌性。从环境的角度来说，孔雀石绿作为污染物在生态环境中，没有资料证明微生物等对其具有代谢能力，同时有研究发现，孔雀石绿可以在体外抑制人谷胱甘肽s-转移酶[3]。

国家已经明令禁止孔雀石绿在水产养殖中的使用，在动物食品中规定不能检出孔雀石绿。孔雀石绿被检出的事件仍时有发生，孔雀石绿进入生物体内会迅速代谢成隐色孔雀石绿（Leuco Malachite Green，LMG），并在生物体内富集[4]，因此建立孔雀石绿和隐形孔雀石绿检测方法十分必要。目前，国家标准中孔雀石绿常用的检测方法有高效液相法和液相质谱法[5]，其中高效液相法定量准确，对氧化柱和流动相的要求较高[6]，液相质谱法定性准确，不需要柱后衍生[7]。本文建立一种孔雀石绿的检测方法，用乙腈提取，中性氧化铝柱萃取柱净化，建立超高效液相色谱质谱检测方法，同位素内标定量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品来源：超市购买；孔雀石绿盐酸盐标准品（80.0%），佳途科技；隐色孔雀石绿标准品（96.8%），佳途科技；孔雀石绿盐酸盐-D5标准品（97.6%），上海安谱实验科技股份有限公司；隐色孔雀石绿-D6标准品（99.0%），上海安谱实验科技股份有限公司；甲酸、乙腈：色谱纯，迈瑞达公司；乙酸铵：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；试验用水：符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/ T 6682—2008）中一级水的规定。

1.2 仪器与设备

0.22μm PETF针式过滤器、中性氧化铝小柱，上海安谱实验科技股份有限公司；Agilent 1290-6470超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪；立式高速冷冻离心机（HR/T20MM），湖南赫西仪器装备有限公司；多管涡旋混合器（EFAA-HM-01），上海安谱实验科技股份有限公司；旋转蒸发仪，德国IKA有限公司，RV 10 Basic V系列；超声波清洗机，深圳市钰洁设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

孔雀石绿和隐色孔雀石绿标液配制：称取13.10 mg 的孔雀石绿盐酸盐标准品，用乙腈溶解并定容至 100 mL，混匀，配制成浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，-18 ℃避光保存。用移液管取上述100 μL标准储备液至100 mL容量瓶中，配制成100 ng·mL-1的孔雀石绿工作液，现配现用。

称取10.30 mg的隐色孔雀石绿，用乙腈溶解并定容至100 mL，混匀，配制成浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，-18 ℃避光保存。用移液管取上述 100 μL标准储备液至100 mL容量瓶中，配制成 100 ng·mL-1的隐色孔雀石绿工作液，现配现用。

孔雀石绿内标和隐色孔雀石绿溶液配制：称取10.00 mg的孔雀石绿-D5，用乙腈溶解并定容至 100 mL，混匀，配制成浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，-18 ℃避光保存。

称取10.00 mg隐色孔雀石绿-D6标准品，用乙腈溶解并定容至100 mL，混匀，配制成浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，-18 ℃避光保存。用移液管取上述孔雀石绿内标储备液和隐色孔雀石绿内标储备液 100 μL至100 mL容量瓶中，配制成100 ng·mL-1的孔雀石绿及其代谢物工作液，现配现用。

1.3.2 样品制备和前处理方法

取样品可食用部分用破壁机打碎，称取5.00 g样品于50 mL离心管中，加入100 μL孔雀石绿及其代谢物内标工作液，涡旋1 min，加入10 mL乙腈溶液，振 荡 提 取5 min，超 声5 min，以10 000 r·min-1离心5 min，将提取液倒入容量瓶中，在样品中再加入 10 mL乙腈溶液，振荡提取5 min，超声5 min，以10 000 r·min-1离心5 min，合并两次提取液，定容至25 mL，中性氧化铝柱先用5 mL乙腈活化，加入 5 mL提取液过柱收集滤液，再加入2 mL乙腈淋洗小柱，合并两次滤液，50 ℃旋蒸至近干，用1 mL 50%的乙腈水定容，通过0.22 μm PETF滤膜于进样瓶中，上机测定。

1.3.3 标准曲线的配制

分别取10 μL、20 μL、30 μL、50 μL、80 μL、100 μL和500 μL孔雀石绿和隐色孔雀石绿工作液于5 mL容量瓶中，分别加入100 μL孔雀石绿及其代谢物内标工作液，用50%的乙腈水定容5 mL，通过 0.22 μm PETF滤膜于进样瓶中，上机测定。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus RRHD C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流 速：0.3 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL；流动相A为乙腈-流动相B 5 mmol·L-1乙酸铵+0.1%甲酸，洗脱程序见 表1。

表1 液相色谱洗脱程序

1.3.5 质谱条件

离子源类型：ESI电喷雾源；离子化模式：正离子模式；使用的碰撞气：氮气N2；毛细管电压：4 000 V；离子源温度：350 ℃；扫描模式：MRM模式（多反应离子扫描）。对应目标物质的离子对、质谱仪设置参数见表2。各物质的定量离子图谱，见图1。

表2 孔雀石绿及其代谢物的质谱优化参数

2 结果与分析

化合物的标准曲线、检出限和定量限如表3所示，线性关系良好，相关系数r2≥0.995可满足检测需要，通过目标物在空白样品中的信噪比，计算出检出限和定量限，由表3中数据可知，结果可达到检测要求。

准确称取空白样品18份，每份5.00 g，共3组，6个平行，分别定量加入低、中、高（0.3 μg·kg-1、 0.9 μg·kg-1、1.2 μg·kg-1）共3个水平的孔雀石绿和隐 色孔雀石绿工作液，测得加标回收率71.6%～ 110.4%，相对标准偏差为0.7%～5.0%。详见表4。

表3 方法的线性方程、检出限和定量限

表4 空白样品加标回收率和精密度

图1 各物质的定量离子图谱

3 结论

本研究建立了一种HPLC-MS/MS测定水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的方法。用乙腈直接提取水产品中的孔雀石绿，用中性氧化铝柱除杂，用同位素内标法对化合物进行定量。结果表明，本方法回收率高，线性好，精密度高。本方法能快速测定水产品中的孔雀石绿，满足国家标准要求。