稳定同位素内标在小麦脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）检测中的作用

徐长亮，陈相宇，曹天亚，卞 军，郝国辉

（1.宿迁市农畜产品质量检测中心，江苏宿迁 223800；2.宿迁市宿豫区农产品质量检验检测中心，江苏宿迁 223800； 3.江苏省农产品质量检验测试中心，江苏南京 210036）

粮食在种植、收获、加工、运输和储存过程中易被真菌感染而产生真菌毒素，这些真菌毒素随着粮食及其制品进入食物链，最终可能引起人或动物的致癌、致畸等病变。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又名呕吐毒素，对粮食污染最为普遍，且玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇容易动态积累[1]。人和动物食用呕吐毒素超标的食物后容易出现恶心、呕吐、胃部不适、免疫抑制以及生殖异常等症状[2]。因此，检测粮食中的真菌毒素，能够保障粮食食用安全。

呕吐毒素的检测技术有很多，如薄层色谱法[3]、高效液相色谱法[4]、气相色谱法、酶联免疫吸附法[5]、胶体金免疫层析法[6]、时间分辨荧光免疫法以及化学发光免疫分析法等。近年来，液相色谱串联质谱法因其检测周期短、灵敏度好、准确度高和重复性优异而被广泛应用在多种真菌毒素检测中。本文根据实验室现有条件，采用《粮油检验 主要谷物中16种真菌毒素的测定 液相色谱-串联质谱法》 （LS/T 6133—2018）[7]对小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）进行检测，并对同位素内标法和外标法进行定量比对，同时也对该方法中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法检出限和方法定量限进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）标准溶液，购自Dr公司；乙腈、甲醇、乙酸铵和乙酸，均为色谱纯，购自Merk公司；0.22 μm滤膜，购自天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters TQS 高效液相串联质谱仪（美国Waters公司）；PL602E电子天平（梅特勒-托利多公司）；TG16-WS离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；振荡器（Talboys公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品提取

正确称取5.00 g小麦粉于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸混合液（体积比为70∶29∶1）对样品进行提取，涡旋振荡提取30 min，然后离心 10 min（离心速度不低于6 000 r·min-1），吸取0.5 mL 上清液于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL水并涡旋混匀，在4 ℃下离心10 min（离心速度不低于 12 000 r·min-1）），取上清液过0.2 μm聚四氟乙烯 滤膜，收集滤液。一份滤液直接上机测定，一份取180 μL滤液，并加入20 μL稳定同位素内标后，涡旋混匀，供液相串联质谱仪测定。

1.3.2 标准曲线的绘制

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）标准溶液逐级稀释成两份0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.6 mg·L-1、0.8 mg·L-1和1.0 mg·L-1系列标准溶液，一份直接上机测定，一份取180 μL标准溶液加入20 μL稳定同位素内标后，涡旋混匀，供液相串联质谱仪测定。

图1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其同位素内标离子图

2 结果及分析

2.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其同位素离子图

同位素是指原子序数（质子数）相同而质量数（中子数）不同的元素，可分为稳定性同位素和放射性同位素。稳定性同位素是天然存在的，目前技术手段检测不到放射性的一类同位素。与放射性元素示踪技术相比，稳定性同位素技术无辐照伤害、安全、不受半衰期的影响，可适用于长时间的示踪实验。同位素内标法，应该是目前最准确的分析方法，因为他们结构一样，唯一的区别是H被D（或者是C及其他原子）取代，推测其离子化效率，分离度等几乎一样。通过检测得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其同位素离子图见图1，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其同位素内标离子的保留时间基本一致。

2.2 标准曲线

以待测毒素及其对应内标的浓度比为横坐标，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和内标峰面积比为纵坐标，对各个数值点进行最小二乘线性拟合，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）同位素内标法拟合曲线，线性方程为Y=172.082X+2 015.03，相关系数为0.998 2。

以待测毒素浓度比为横坐标，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）峰面积比为纵坐标，对各个数值点进行最小二乘线性拟合，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）外标法拟合曲线，线性方程为Y=422.021X- 34 359.1，相关系数为0.993 0。

2.3 方法检出限和定量限验证

按照LS/T 6133—S/T 方法，分别在样品中加入方法检出限和定量限浓度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）标准物质，按照提取过程进行处理后得到结果。对添加浓度为45 μg·kg-1的样品（浓度与方法检出限一致）检测，7次测量结果的平均回收率为87%，相对标准偏差为6.4%；对添加浓度为150 μg·kg-1样品（浓度与方法定量限一致）检测，7次测量结果的回收率为98%，相对标准偏差为2.8%。

依据《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417证指南行处）对结果进行相应评定，发现实验室具备使用LS/T 6133—2018对脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）进行检测的能力。

2.4 小麦标准物质外标校正结果与内标校正结果分析

按照LS/T 6133—2018方法对国家二级标准物质小麦粉（GBW（E）100382）中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）进行检测，并分别使用内标法及外标法拟合曲线进行校正分析，检测结果如表1所示。

依据《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》（GB/T 32465—2015）标准，使用有证标准物质对结果正确度进行判定，小麦有证标准物质 （GBW（E）100382）中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）使用稳定同位素内标法校正结果与标准值的偏差为0.26，小于一倍标准值偏差（0.30 mg·kg-1），符合偏差要求，结果准确；使用外标法对其进行校正的结果与标准值的偏差为1.37，大于3倍标准值偏差，不符合准确度要求，结果不准确。

表1 小麦标准物质脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）结果分析

3 结论

按照《粮油检验 主要谷物中16种真菌毒素的测定 液相色谱-串联质谱法》（LS/T 6133—2018）对脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行检测，检测过程简便快捷，提取步骤精简方便，稳定同位素内标法得到的检测结果准确可靠，精密度符合要求，是目前检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇和其他真菌毒素比较有优势的检测方法。但目前市场上稳定同位素内标购买价格高昂，期待稳定同位素内标商品化后的价格能够有所降低。