禽传染性喉气管炎病毒分离鉴定及gD 基因序列分析

何云凤，顾宇华，匡华丽，李蕴玉，李佩国

（河北科技师范学院动物科技学院预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066604）

传染性喉气管炎（infections laryngotracheitis，ILT）是由双链DNA 疱疹病毒1 型（通常称为传染性喉气管炎病毒，ILTV）引起的家禽急性上呼吸道疾病[1]。ILTV 主要通过呼吸道和消化道感染，患病禽和带毒禽以及畜舍内被污染的垫料是其主要传染源。也有报道[2]称，接种活疫苗的鸡可长时间排毒，感染后康复鸡可排毒两年。该病在一年四季都可发生，但秋冬季节发病率更高一些。ILTV可感染不同日龄的禽，青年和成年禽群感染后常呈现急性暴发，产蛋禽感染后出现产蛋率急剧下降甚至停产现象，雏禽也可感染，但较为少见[3]。该病有很高的发病率和死亡率，给养禽业造成了巨大威胁。

2021 年12 月，河北省沧州市一养殖场饲养的510 日龄蛋鸡发生了以鸡冠边缘发绀、发出怪音、张口伸脖为主要症状的疾病。剖检可见：气管有血及血样分泌物，喉头有干酪样假膜，卵泡充血呈红色，腺胃发软，肠黏膜变薄，内容物稀薄，扁桃体轻度出血。本研究以该养殖场病死鸡为研究对象，从气管组织中分离病原，通过PCR 扩增、序列分析确定为ILTV，并分析了分离毒株的遗传变异情况，以期为河北省ILT 防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SPF 鸡胚，购于北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；0.22 μm 滤膜，购自密理博中国有限公司；2×EsTaqMaster Mix（Dye），购自康为世纪生物科技有限公司；病毒核酸提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；ILTV、禽传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、J 型禽白血病病毒（ALV）核酸，由本实验室保存；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒，均购自北京天根生化科技有限公司；pMD18-T 载体、DNA 连接酶、大肠杆菌DH5α 感受态细胞，均购自宝生物工程（大连）有限公司；第一链cDNA 高效合成（逆转录）试剂盒，购自亚太恒信生物科技（北京）有限公司。

1.2 样品来源和处理

样品为来自河北省沧州市养殖户送检的疑似ILTV 感染病鸡的气管组织样品。将组织样品用无菌剪刀剪碎后，与无菌PBS 按体积比1:5 混合，用组织匀浆机充分混匀；将匀浆液反复冻融3 次，4 ℃ 12 000 r/min 离心2 min，取上清液，经0.22 μm 滤膜过滤后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 引物设计

参照文献[4]合成ILTVgD基因序列，参照文献[5]合成IBVS1基因序列，参照文献[6]合成NDVF基因序列，参照文献[7]合成ALVgp85基因序列。所有引物由上海生物工程有限公司合成（表1）。

表1 PCR 扩增引物序列

1.4 病毒分离

取上述病料匀浆上清液接种9 日龄 SPF 鸡胚尿囊腔，每胚0.2 mL；接种等量高压灭菌的PBS作为阴性对照，置孵化器内孵育；弃去24 h 内死亡鸡胚，72 h 后取出鸡胚于4 ℃冰箱过夜；收集鸡胚绒毛尿囊膜研磨后接种9 日龄SPF 鸡胚，连续盲传3 代；收获每代的鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，并观察鸡胚与鸡胚绒毛尿囊膜病变情况。

1.5 分离病毒PCR 扩增及序列分析

参照核酸提取试剂盒说明，提取第3 代鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液的核酸进行RT-PCR 和 PCR 反应。逆转录反应条件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。以上述提取的DNA 和逆转录得到的cDNA 为模板，对ILTV、IBV、NDV、ALV 进行PCR 扩增，取5 μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测；将ILTV gD基因扩增产物纯化回收后连接 PMD-18T 载体，连接产物转化DH5α 感受态细胞；挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB 液体培养基，37 ℃振荡培养过夜；用质粒小提试剂盒提取质粒，经PCR 检验后，将阳性重组质粒送生工生物工程股份公司测序。

1.6 遗传进化分析

应用DNAMAN 软件对测序结果进行拼接，以GenBank 数据库中的ILTV 疫苗株、国内外部分流行株作为参考株，利用MEGA7.0 软件对分离株和参考株的gD基因核苷酸和推导氨基酸序列进行比对，利用DNAstar 7.1 软件中的MegAlign 程序进行ILTVgD基因核苷酸同源性分析，并采用Neighbor-Joining 方法构建ILTV 分离株及参考株gD基因系统发育树，boot strap 设置为1 000 次重复。参考毒株信息见表2。

表2 参考株信息

1.7 gD 蛋白生物信息学分析

采用SOPMA 在线服务器预测分离株与参考株gD基因编码蛋白的二级结构，采用YinOYang-1.2、NetNGlyc-1.0 在线服务器分别预测分离株与参考株O-连接和N-连接的糖基化位点。

2 结果

2.1 病毒分离

病料匀浆上清液接种9 日龄鸡胚后，初次传代的鸡胚在接种后120 h 内未见死亡，但取出胚体后可见胚体体积小于对照组。收集尿囊液并用滤膜过滤除菌，继续接种鸡胚，传至第3 代时，鸡胚在接种后48 h 开始出现死亡，打开鸡胚气室可见鸡胚绒毛尿囊膜出现痘斑，胚体取出后可观察到胚体蜷缩，双爪弯曲呈抱头样，死亡胚体表面可见明显出血点，符合ILTV 致鸡胚病变表现，而对照胚体无肉眼可见病变，表明在鸡胚尿囊液中成功分离出ILTV。

2.2 病料样品PCR 检测

以前述所提第3 代鸡胚尿囊液的DNA 和cDNA 为模板，采用IBV、NDV、AIV、ILTV 特异性引物进行PCR 扩增。结果（图1）显示，病料样品中NDV、AIV、IBV 均为阴性，仅ILTV 为阳性，凝胶电泳显示约1 133 bp 的条带，表明鸡胚尿囊液中存在ILTV，分离得到1 株ILTV，将其命名为Hebei2021 株。

图1 ILTV 分离株gD 基因PCR 结果

2.3 ILTV gD 基因核苷酸同源性结果分析

应用DNAMAN 软件对测序结果进行拼接，发现gD基因分离株核苷酸长度为1 133 bp，编码377 个氨基酸。应用DNAstar 7.1 软件中MegAlign程序进行ILTVgD基因同源性分析，发现分离株与河南、黑龙江、江苏分离株的gD基因序列同源性为99.0%～99.4%，与国内K317 株弱毒疫苗株（JX458824）同源性为99.4%，与澳大利亚、埃及、韩国参考株同源性为99.4%～99.5%（图2）。

图2 ILTV 分离株与参考株核苷酸同源性分析结果

2.4 ILTV gD 基因遗传进化分析

利用MEGA7.0 软件构建的遗传进化树（图3）显示，江苏分离株单独在一分支上，河北分离株与其他国内参考株、国内疫苗株以及国外参考株在同一分支上，表明河北分离株与国内疫苗株，河南、黑龙江参考株，以及澳大利亚、韩国、埃及参考株亲缘关系近，而与江苏分离株亲缘关系相对较远。

图3 ILTV 分离株与参考株gD 基因分子进化树

2.5 ILTV gD 蛋白氨基酸序列分析

采用MEGA7.0 软件对河北分离株和国内疫苗株及国内外参考株进行ILTV gD 蛋白氨基酸序列比对。结果（表3）显示：与疫苗株相比，河北分离株在3、219 aa 两位点分别发生了T3A、V219Q突变；与河南、黑龙江、江苏分离株相比，河北分离株与其分别在3、23 aa，3、208、282、334 aa，3、71、107 aa 等位点处发生了突变，分别为T3A、H23L，T3A、G208E、Q282R、R334C，T3A、K71E、K107E。

表3 ILTV 分离株、疫苗株、参考株gD 蛋白变异情况

2.6 ILTV gD 蛋白生物信息学分析

分离株与参考株蛋白二级结构均包含α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链，且分离株的无规则卷曲含量占肽链的45.89%。α-螺旋、延伸链、β-转角占比分别为35.01%、14.59%、4.51%，部分二级结构预测结果见图4。分离株和疫苗株gD蛋白均可能有49 个O-连接的糖基化位点（图5），分离株和参考株均无N-连接的糖基化位点。

图4 分离株和疫苗株gD 蛋白二级结构预测结果

图5 分离株和疫苗株O-连接的糖基化位点预测结果

3 讨论

本试验通过鸡胚传代、PCR 扩增、测序分析，成功分离鉴定出1 株ILTV。gD基因具有高度保守性[8]，其编码的糖蛋白是病毒的主要保护性抗原，能够诱导机体产生细胞和体液免疫应答，同时也是病毒主要抗原之一，是病毒吸附、穿入、复制所必需的[9]，故本试验对ILTV 的gD基因序列进行了相关分析。gD基因核苷酸序列同源性分析发现，河北分离株与疫苗株及国内外参考株的同源性均在99.0%以上；氨基酸序列比对发现，河北分离株与参考株绝大部分位点的氨基酸序列一致，仅极个别位点发生了突变，表明分离株的gD基因序列较为保守，遗传进化较稳定。gD 蛋白二级结构预测和糖基化预测发现，分离株和疫苗株相比并未发生突变。

通过询问该养殖场人员得知，该养殖场近半年内未进行ILT 免疫，因此可以认为该分离株为自然感染的野毒株。分离株与弱毒疫苗株的gD基因序列在遗传进化关系上很接近，因此只要正确合理地进行疫苗免疫，就可以使鸡群产生较好的免疫保护力。但是也有文献[10]报道，疫苗毒引发埃及养殖场疫情，这也提示存在疫苗毒株毒力返强的风险，因此在未发生疫情地区应慎重使用弱毒疫苗免疫，即使是在疫情发生区，在接种ILTV 弱毒疫苗后也应采取相应的生物安全防护措施，防止疫苗病毒感染周围健康鸡群。

为了预防ILTV 感染，一定要加强禽群的饲养管理，采用全进全出的养殖模式，禽舍要定期通风换气，降低饲养密度，降低舍内粉尘和氨气浓度[4]。早期诊断对于防控ILT 十分重要，应定期观察禽群的临床表现，对出现呼吸困难的病禽要立即隔离，并采集病禽的喉头气管分泌物送实验室进行PCR 检测[11]。由于病禽和康复禽体内可能带毒，从而成为本病的主要传染源[12]，所以易感禽群应与康复禽群分开饲养，及时淘汰康复禽群，以减少ILT 发生和流行所带来的损失。