CRISPR/Cas9技术在乙肝治疗中的研究与进展

彭海航，靳春鹏

·综述·

CRISPR/Cas9技术在乙肝治疗中的研究与进展

彭海航*，靳春鹏*

100160 北京，国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心

慢性乙型肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。CHB 包括乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）阳性的 CHB 患者及 HBeAg 阴性的 CHB 患者。流行病学调查结果显示，我国原发性肝癌（PLC）患者乙肝表面抗原 HBsAg 阳性率高达 90%，而 PLC 主要在肝硬化基础上发生，提示HBV 长期持续感染最终可导致肝硬化及 PLC[1]。

病毒性肝炎每年导致多达 134 万人死亡，并且仍然是肝硬化和肝细胞癌发病率和死亡率的主要原因[2]。乙型肝炎病毒（HBV）感染对全球健康问题的影响很大，估计有 2.57 亿人长期感染，特别是中国，拥有约 1.2 亿乙肝病毒携带者。虽然在疫苗和抗病毒药物开发方面取得了有价值的进展，全球预防性疫苗接种计划降低了 5 岁以下儿童的 HBV 流行率，但在非流行的非洲国家覆盖率不足，意味着一些国家的患病率仍然很高[2]。

目前，批准的治疗剂包括干扰素α、聚乙二醇化干扰素 α、拉米夫定、替比夫定、腺病毒二倍体、恩替卡韦、替诺福韦地索普西富马酸盐和替诺福韦艾拉酚胺。这些治疗剂有时会因施用周期长，患者选择的种类以及是否有利于同时或顺序给药的观点相互矛盾而有所不同[3]。但是仍然没有可靠的治疗 HBV 感染的方法。而且治疗的关键限制是它们无法可靠地实现精准的病毒学治疗[4]。

随着基因打靶技术的出现，使得精准的病毒学治疗成为了可能。经典的基因打靶技术是基于 DNA 同源重组原理，用设计的同源基因片段替代靶基因片段，但是这种打靶技术在体细胞中的成功率极低。之后发展出的 ZFN（zinc finger nucleases）、TALEN（transcription activator-like effector nucleases）等技术，是基于 DNA 双链断裂（double strand broken，DSB）修复的非同源末端连接机制（non homologous end-joining，NHEJ），通过蛋白-DNA 相互作用识别特定 DNA 序列，在修复过程中引入外源 DNA 从而引起移码突变，但是此类技术的局限性在于构建融合蛋白的工作量大、成本高。2013 年，、、等杂志几乎同时报道了一种新型的基因组编辑手段—— CRISPR/Cas9 技术（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated system）。从表 1 的结果可以看出[5]，与传统的基因编辑技术 ZFN 和 TALEN 相比，该技术具有良好的靶向性、构建简单、可同时操作多条基因等优点，并迅速成为生物医学领域的前沿热点，引发了新一轮的基因治疗研究热潮。

特别是针对乙肝病毒 cccDNA 设计的三种类型的打靶方式，通过比较可以发现，CRISPR/Cas9 技术具有极高的剪切效率，因此，采用 CRISPR/Cas9 技术进行 HBV 的打靶治疗变成了重要的研究方向。

表1 三种基因编辑技术比较

本文整理了最新文献报道，从 CRISPR/Cas9 的技术原理、研究进展、用于 HBV 基因治疗的可行性及建议等多个方面进行综述。

1 CRISPR/Cas9 技术的历程

聚集的规则间隔短回文重复（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统是在细菌和古细菌中发现的防御机制[6-10]。CRISPR 基因座由小的独特序列组成，称为“间隔区”，它们是整合到称为“CRISPR 重复序列”的高度保守的重复 DNA 序列的延伸中。这些遗传元件首先在大肠杆菌的碱性磷酸酶（iap）基因的 3' 末端区域中被鉴定，其包含一组 29 个核苷酸重复序列和 32 个随后序列，发现超过40%的细菌和 90%的古细菌在其基因组中含有这些短的规则间隔重复[11]。间隔区的序列是宿主基因组外来源的，比如来源于噬菌体、病毒和质粒。将这些外源 DNA 整合到宿主基因组中可以抵抗入侵病原体对细菌和古细菌的抵抗。由这些基因编码的 54 种 Cas 蛋白通常携带与核酸酶、解旋酶、聚合酶和核苷酸结合蛋白相似的功能结构域[8]。CRISPR/Cas9 系统可以跨越不同的细菌属转移，以赋予对侵入性核酸的异源抗性[12]。

在自然条件下，Cas9 是无效的，只有当 Cas9 与 sgRNA 结合时才有效。Cas9 和 sgRNA 形成复合体之后，然后通过识别 PAM 及搜寻 PAM 附近的目标 DNA 序列，然后 sgRNA 与靶标结合序列结合后，靶序列链被HNH 切割并且靶序列的相反链被 Ruv C 切割[13-16]。

从图 1 可以看出，当 Cas9 的 HNH 和 Ruv C 对 DNA 切割后形成 DSB 时，则形成 CRISPR/Cas9 系统激活 DSB 的修复机制[16]。一种是同源定向修复（HDR），另外一种是非同源末端连接（NHEJ）。HDR 是一种无错误的方法，它只加入同源模板，常用于植物中。与 NHEJ 相比，它更复杂[17-19]。虽然 NHEJ 是一种容易出错的方法，但它能够插入或删除特定的基因序列和引起 Indels 突变。因此，它通常用于基因敲除[17, 20]。

从目前的实践中证明，sgRNA 和 Cas9 蛋白足以诱导多种系统中的靶 DNA 结合和切割，包括培养的人类细胞、大鼠、小鼠、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、果蝇、细菌、拟南芥等[21-28]。这种双组分系统可以通过靶向任何具有 PAM 形式的 DNA 序列来使用，使其成为可应用于各种场景的通用工具。

2 CRISPR/Cas9 技术在乙肝治疗中的应用

在采用基因编辑技术针对乙肝病毒 HBV 治疗的过程中，一般有两种形式，即直接靶向 HBV DNA 中的靶点来抑制 cccDNA，另外一种形式是通过调节其他因子来抑制 cccDNA 的复制。下面分别针对这两种情形进行分析。

栽后第1年的幼树根系不发达，加之定植穴内已施入一定肥料，为防止伤根烧根可不施入肥料。第2年起一定要逐年施肥。重视扩穴施肥提高建园质量，为果园优质高效打好基础。

2.1 CRISPR/Cas9 技术在靶向 HBV DNA 靶点中的应用

目前，已经证实 CRISPR/Cas9 系统可以在细胞层面以及小鼠动物模型层面有效地破坏 HBV 基因组模板，有的可以抑制或降低 cccDNA 的量，具体总结见表 2。

要彻底清除乙肝患者体内的 HBV，寻求从根源上清除 cccDNA 是达到治愈乙肝的有效路径。Liu 等[29]基于金黄葡萄球菌（Sa）的 Cas9 系统设计了5 个针对不同靶标基因的 gRNA，其中 3 种被证明是有效的，其中靶向 preC/C 靶点的 Sa3 gRNA 效果最好。该SaCas9 系统显著降低 Huh7、HepG2.2.15 和 HepAD38 细胞中的 HBV 抗原表达以及 pgRNA 和 cccDNA 水平。这些细胞系中 gRNA/SaCas9 的双重表达导致更有效的 HBV 基因组切割。在小鼠模型中，流体动力学注射 gRNA/SaCas9 质粒导致 HBV 蛋白表达水平显著降低。另外还使用 AAV 载体将 SaCas9 系统递送到具有持续 HBV 复制的小鼠中，当注射较高滴度的 AAV 时，观察到乙型肝炎表面抗原（HBsAg），HBV DNA 和 pgRNA 水平降低。

Li 等[30]首次利用 VIII 型腺相关病毒（AAV8）介导小型化CRISPR-SaCas9 系统通过剪切HBV 转基因小鼠体内的 HBV DNA，高效抑制了小鼠血清及肝组织中的乙肝病毒标志物。具体的，利用筛选出的靶向 HBV 核心区的小型化 CRISPR-SaCas9 系统，在腺相关病毒（AAV8）的介导下通过静脉注射入 HBV转基因小鼠体内，在注射 2 周后 HBV 转基因小鼠血清中的乙肝标志物开始下降，在注射1 个月后，相比注射 AAV 空载体的对照组，实验组小鼠血清中的 HBV DNA 的含量降低了 94.24%、HBsAg含量降低了 62.96%、HBeAg含量降低了 65.18%（< 0.05，n = 7）。此外，研究人员还通过深度测序确认了 CRISPR-SaCas9 系统对 HBV DNA 核心区域的高效剪切，同时未检出脱靶效应，进一步证实了 CRISPR/Cas9 技术在乙肝基因治疗中的潜力。

图 1 CRISPR/Cas9 工作原理图

表 2 CRISPR/Cas9 靶向 HBV 的重点研究汇总表

注：N.D. 代表未描述。

Lin 等[31]报道了 CRISPR/Cas9 系统可用于在体外和体内破坏 HBV 基因组。当 Cas9 和 HBV 表达质粒共转染到 Huh7 肝细胞来源的癌细胞中时，HBV 特异性 Cas9/sgRNA 组合能够显著降低 HBV 核心和 HBsAg 的产生。此外，该系统可有效降低 HBV 流体动力学-小鼠模型中肝内 HBV 表达载体的水平和 HBsAg 的血清水平。通过设计针对 HBV S 的第 30 个密码子编码 HBV 表面抗原（HBsAg）的 gRNA，可以完全停止 HBsAg 表达并减少病毒粒子的分泌，这也说明完全停止 HBsAg 的表达是可行的[45]。

Kennedy 等[34]使用 Cas9 和 HBV 特异性 gRNA 的慢病毒转导，证明慢性 HBV 感染（HepAD38 细胞）和新生感染（HepaRG 细胞）的体外模型中 HBV DNA 产生和cccDNA 积累的有效抑制情况。结果发现，CRISPR/Cas9 系统将总 HBV 病毒 DNA 水平抑制高达 1000 倍，cccDNA 水平高达 10 倍。Seeger 和 Sohn[32]证明，在牛磺胆酸钠协同转运多肽（NTCP）表达 HepG2 细胞时，HBV 特异性指导 RNA 可以将 HBV 感染抑制高达 8 倍。在另一项研究中，Liu 等[36]报道 HBV 特异性 gRNA/Cas9 可以抑制体外和体内不同基因型 HBV 的复制，这是由于病毒 DNA 模板的清除和易错修复。

Zhen 等[39]设计了 gRNA 靶向 HBV 表面蛋白的 ORF，在体外 HepG2.2.15 细胞模型和体内流体动力学-小鼠模型中通过CRISPR/Cas9 处理降低培养物上清液和小鼠血清中的 HBsAg 水平。另外，CRISPR/Cas9 系统还可有效抑制小鼠肝脏中 HBV DNA 水平和 HBsAg 表达，例如，Dong 等[33]表明 CRISPR/Cas 系统可用于抑制preC/C DNA 转染的 Huh7 细胞和携带 HBV cccDNA 的新小鼠模型中的细胞内 cccDNA 和病毒复制。Ramanan 等[37]研究表明，靶向 HBV 保守区的 sgRNA 在体外和体内都会引起病毒复制的强烈抑制，并将这种抗病毒活性扩展到从患者体内分离的病毒。Wang 等[38]将双重 gRNA 应用于引导的 CRISPR/Cas9 系统，以使体外基因型 A-D 的 HBV 失活。

在最近的 HBV 和 CRISPR 研究中，Karimova 等[35]证明改进的 CRISPR/Cas9 切口酶系统可以破坏HeLa和 HEK293 细胞系中的 HBV cccDNA 和整合的 HBV序列。

另外，一些研究还声称 CRISPR/Cas9 系统可以破坏或灭活 HBVcccDNA 和整合的 HBV 基因组[40, 44, 46]。HBV 目前从基因 A 型到基因 I 型，至少有 9 种 HBV 基因型已被确定[48]，可见 HBV 基因组序列高度多样化，因此设计广谱治疗的 CRISPR 系统也是研究的方向。比如具有多重 gRNA 的 CRISPR/Cas9 可以同时进行切割多个HBV 基因组位点，从而提高 HBV 基因组失活和消耗的效率[37-38, 41, 49]。通过带有八个多重 gRNA 表达单元的腺病毒载体（AdV）不仅可以提供多个基因敲除，还可以解决基因组编辑治疗中的异质靶标和逃逸突变体的问题[50]。然而，只有少数研究检查了脱靶效应通过基因组切割检测测定或潜在脱靶的深度测序来测定 HBV 特异性 gRNA 位点[37, 40-41, 44]。结果表明，深度测序确实比基因组切割更敏感，检测分析可以鉴定 Cas9 核酸酶与 HBV 特异性引起的脱靶效应 gRNAs。两项研究还表明，通过利用可以提高 HBV 基因组切割的特异性 Cas9 切口酶和具有靶向所需 HBV 序列的一对 gRNA，不仅破坏了报告细胞系中的游离型 cccDNA 和染色体整合的 HBV 靶位点，而且破坏了慢性和从头感染的肝癌细胞系中的 HBV 复制，尽管Cas9 切口酶显示出降低裂解功效[35, 41]。总的来说，CRISPR/Cas9 系统能够特异而有效破坏 HBV 基因组而没有明显的细胞毒性。此外，通过靶向 S- 或 X-ORF，成功抑制慢性和新型感染的人肝癌细胞系中的 HBsAg 表达。通过 CRISPR/Cas9 系统靶向 HBx 可有效下调 HBx 基因表达，降低 HBsAg 和 HBV cccDNA 的表达水平[47]。

总之，这些研究证明了 CRISPR/Cas9 系统可在体外和体内破坏 HBV cccDNA，并显示了CRISPR/Cas9 在急性和慢性 HBV 感染中的治疗潜力。

2.2 CRISPR/Cas9 技术通过调节其他因子在抑制 HBV 中的应用

Liu 等[52]认为 p53 突变和 PTEN 表达改变是HBV感染相关肝细胞癌（HCC）中两种最常见的遗传事件。为了证实 p53 和 PTEN 体细胞突变在 HCC 发展中的致病作用，其通过流体动力学尾静脉注射建立了 CRISPR/Cas9 介导的体细胞基因破坏，允许在成体 HBV 转基因小鼠中同时体内靶向 p53 和 PTEN。在注射后 4 个月就导致肉眼可见的肝脏肿瘤，并且大多数肿瘤包含 p53 和 PTEN 功能丧失改变。这项研究表明，CRISPR/Cas9 介导的 p53 和 PTEN体细胞突变加速了成人 HBV 转基因小鼠的肝癌发生。

Qi 等[53]证明，肝细胞的乙型肝炎病毒（HBV）感染开始于与其细胞受体牛磺胆酸钠协同转运多肽（NTCP）结合，然后病毒核衣壳内化到细胞质中。核衣壳中的病毒rcDNA 基因组被转运到细胞核中并转化为cccDNA，以用作当前抗病毒疗法难以控制的病毒持久性储库。已经推测宿主 DNA 修复酶催化 rcDNA 向 cccDNA 的转化，然而，填充 rcDNA 正链中的缺口的 DNA 聚合酶仍有待确定。通过靶向遗传筛选与化学抑制相结合，以确定负责 cccDNA 形成的细胞DNA 聚合酶，并利用衣壳编码缺陷的重组 HBV 感染 HepG2-NTCP 细胞，具有与野生型 HBV 相似的效率，以确保 cccDNA 合成完全来自新发 HBV 感染。DNA 聚合酶 κ（POLK），一种在非分裂细胞中具有最大活性的Y 家族 DNA 聚合酶，在新发 HBV 感染期间实质上有助于 cccDNA 的形成。通过 siRNA 敲低或 CRISPR/Cas9 敲除消除 HepG2-NTCP 细胞中 POLK 的基因表达抑制 rcDNA 向 cccDNA 的转化，同时通过异位有效地拯救敲除细胞中的 cccDNA 形成减少，从而导致病毒感染以及 POLK 的表达。这些研究表明，POLK 是新发 HBV 感染期间 cccDNA 形成所需的关键宿主因子，并表明 POLK 可能是开发针对 HBV 的抗病毒药物的潜在靶标。

2.3 CRISPR/Cas9 技术在治疗 HBV 中的其他改进

在针对 HBV 进行 CRISPR 打靶时，除了针对靶标的设计以及靶标的选择之外，针对方法本身也进行了系列的改进。

Liu 等[54]采用来自金黄色葡萄球菌（Sa）的 Cas9 蛋白，该蛋白比来自化脓性链球菌（Sp）的 Cas9 的分子量要小，因此能够包装到 AAV 载体中。该SaCas9 系统显著降低 Huh7、HepG2.2.15 和 HepAD38 细胞中的 HBV 抗原表达以及 pgRNA 和 cccDNA 水平。这些细胞系中 gRNA/SaCas9 的双重表达导致更有效的 HBV 基因组切割。总之，该 SaCas9 系统准确有效地靶向 HBV 基因组并在体外和体内抑制 HBV复制。该系统由 AAV 载体递送，并且可以用作针对慢性 HBV 感染的新型治疗策略。为了克服 Cas9 的货物容量的障碍，一种替代策略是利用两个 Cas9 片段系统或分裂内含子 Cas9 系统，其中一个全功能的 Cas9 蛋白被分裂成两个无功能的片段，递送至靶细胞后，Cas9 的两个片段通过重组重新发挥功能，这也是一种克服运输障碍的有效手段[55]。当然，SpG 和 SpRY 对 PAM 的要求最低，分别针对 NGN PAM 和 NRN/NYN PAM 也可作为可选的 Cas 选择方案用于 HBV 的切割[56]。

研究表明，高效和可观察的基因组编辑通常需要高滴度的 AAV-SaCas9/gRNA（每只小鼠 > 1011个病毒基因组）[57]。Schiwon 等[58]认为高容量腺病毒载体（HCAdVs）是将大 DNA 分子递送到细胞中的有力工具。在此，HCAdVs 被设计为递送了包含三个 gRNA 的 CRISPR/Cas9核酸酶系统，所述 3 个 gRNA 与hSpCas9 在 pAdV 载体中同时表达，达到一步法即可实现 3 个靶标一次转化完成靶标打靶的操作，并且证明了 cccDNA 拷贝降低以及抗病毒效果。

Wang 等[59]构建了由单个 U6 启动子驱动的新型 gRNA-microRNA（miRNA）-gRNA 三元盒。通过在两个 HBV 特异性 gRNA 之间整合的抗 HBV pri-miR31 模拟物，可以通过 Drosha/DGCR8 处理将两种gRNA 与 gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒的长转录物分离。结果显示，gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒可有效表达两种 gRNA 和 miR-HBV。gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒中的 HBV 特异性 gRNA 和 miR-HBV 可在体外和体内抑制 HBV 复制和破坏 HBV 基因组中发挥协同作用。最重要的是，与RNA 干扰（RNAi）方法一起，HBV 特异性 gRNA 显示出对 HBV cccDNA 破坏的有效活性。由于HBV cccDNA 是消除慢性 HBV 感染的障碍，因此 gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒可能是清除 HBV cccDNA 的潜在工具。虽然 CRISPR/Cas 可能会清除 cccDNA，但确保其安全性是应用的必要条件。Yan 等[60]用肝脏特异性启动子替换原始启动子的重建 CRISPR/SaCas9 系统在体外和体内仍能抑制 HBV 复制。与肝脏相比，SaCas9 在其他器官或组织中的表达进一步降低。这些结果有助于确保 CRISPR/Cas9 系统的作用仅限于肝脏，有助于临床应用，从而通过非特异性靶向其他器官来降低不良和有害影响的可能性。

Li 等[61]采用 CRISPR/Cas9 技术完全切除了一个完整的 3175 bp 整合的 HBV DNA 片段，并在稳定的 HBV 细胞系中破坏了 HBV cccDNA。在 HBV 切除的细胞系中，细胞内的 HBV cccDNA，上清液 HBV DNA、HBsAg 和 HBeAg 保持低于负临界值超过 10 个月。此外，通过全基因组测序，分析了脱靶效应并排除了细胞污染。这是第一次在稳定的 HBV 细胞系中完全根除 HBV 感染。这种大片段的切除方法，为 HBV 的治疗提供了一种可行的实施策略。

此外，将 CRISPR/Cas9 成分安全有效地递送到 HBV 感染的肝细胞的细胞核中对于 HBV 基因组的体内基因编辑至关重要[62]。CRISPR/Cas9 常用的载体主要是非病毒载体，例如脂质或聚合物，具有灵活的载货能力和临床应用中的高安全性[63]。其中 LNP 已经成功用于递送 CRISPR/Cas9 RNPs[64]并且展示了对 HBV 基因组的显著编辑[65]。LNP-mRNA 介导的 CRISPR/Cas9 为开发未来的 CHB 基因疗法提供了强有力的支持[66]。近红外响应仿生纳米粒子（UCNPs-Cas9@CM），也可以有效地传递 Cas9 RNP（即核糖核蛋白复合物，由化学合成的 crRNA、tracrRNA及 Cas9 蛋白组成，化学合成 crRNA 和 tracrRNA 与 Cas9 蛋白混合后转染细胞，可快速实现靶基因的编辑。与传统 Cas9/gRNA 质粒转染相比，基因编辑效率更高，脱靶效应更低，且无 DNA 整合的风险，是更加理想的基因编辑系统），发现 HBV 感染细胞中的 HBsAg、HBeAg、HBV pgRNA 和HBV DNA 以及 cccDNA 被抑制，实现对 HBV 治疗的有效基因组编辑。这些发现在 HBV-Tg 小鼠中得到证实，该小鼠没有表现出显著的细胞毒性和最小的脱靶 DNA 损伤[67]，这也是未来治疗的一个重要途径。

多种治疗方式联合也是重要的研究方向。Zhen 等[68]通过抗 HBV 与抗 PD-1 联合治疗抑制 HBV 表达，显著提高 HBV 转基因小鼠的存活率。此外，联合治疗增加了T 细胞产生的干扰素，进而增强了 Th1 相关免疫刺激基因的表达，从而降低了调节/抑制免疫基因的转录。这些结果表明 HBV 靶向治疗与 PD-1 免疫检查点阻断联合具有很强的协同作用，从而支持了该联合治疗策略在 HBV 感染临床治疗中的转化潜力。

4 结语与展望

CRISPR/Cas9 技术给人类疾病治疗的研究带来了巨大的便利性、高效性和灵活性，也开启了精准医疗的新篇章，为个体定制化医疗打下了坚实的基础。CRISPR/Cas9技术治疗乙肝目前还处于较为早期的研发阶段。但已有少数公司据此开始了慢性乙型肝炎根治疗法的商业化开发。例如 Intellia Therapeutics，由CRISPR 发现者之一的 JenniferA. Doudna 创立于 2013 年。该公司最新的一次乙肝治疗相关成果公布在其2016 年的年报，显示其相关研究还处于细胞水平。笔者相信在以后必然会有长足的发展和进步。使用基因编辑的方法彻底治愈乙肝，还需要解决以下一些问题：

第一，脱靶现象。需要尽可能降低基因编辑工具的脱靶率，让其精准破坏 cccDNA 等病毒核酸而不影响机体细胞的正常基因组及其他核酸序列。

第二，提高基因编辑系统的体内递送效率。通过优化递送系统，将基因编辑工具准确高效地递送到需要编辑的细胞里。

第三，尽量回避或克服免疫系统对基因编辑的影响。因为这些用于基因编辑及递送的工具，多是一些外源物质，可引起机体免疫或毒性反应。加速好不容易导入体内的基因编辑工具的清除，同时给细胞及机体组织造成伤害。

第四，提高打靶效率。可以通过使用多个 gRNA 一起打靶，或者与其他的基因修饰方式比如小干扰 RNA 联用，从而获得更佳的效果。

第五，在 CRISPR 基础上联合其他方式治疗。正如在前所述，通过敲除 HBV 基因以及抑制 PD-1 可以有效地提高治疗效果。在 CRISPR 靶向治疗的基础上，同时给予其他治疗药物的联用，从而提高治疗效果，也是重要的研究方向。

由于 CRISPR/Cas9 技术还未真正应用于临床治疗，因此，其安全性与稳定性仍需要进一步完善，但是不可否认， CRISPR/Cas9 系统因其非凡的灵活性和便利性在临床应用中将展现出革命性的潜力[69]，在乙肝治疗方面将具有极大的应用前景，治愈乙肝也变得不再遥不可及。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.007

彭海航，Email：haisunshine@126.com

2022-07-04

*同为第一作者