血管性痴呆动物模型研究概述

孙旭，王蕾，赵婧，韩雪

（1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学第二附属医院，山东 济南 250014）

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是一种由脑血管因素引起的以高级皮层功能减退为主要表现的痴呆综合征，是最常见的痴呆类型之一[1-2]。血管性痴呆以脑血流量（cerebral blood flow，CBF）明显减少为典型特征。研究表明，亚洲地区65岁以上人群中痴呆的患病率约为5%，而血管性痴呆占痴呆患者的20%左右[3]。目前，有关血管性痴呆的发病机制尚未明确，而有关其临床科研设计方面的动物模型亦无统一标准[1]。开展临床研究的条件要求较多，而动物实验的可控性较好。选择合适的动物模型是进行医学研究的前提。目前，动物模型仍为研究血管性痴呆发病机制、病理学改变、认知功能损害特点和防治措施等的有效工具。以下对近年来血管性痴呆动物模型的实验动物选择及各类血管性痴呆动物模型制备方法进行综述。

1 血管性痴呆动物模型的实验动物选择

血管性痴呆研究的实验动物主要以大鼠、小鼠、沙鼠作为研究对象。近年来有对灵长类动物开展的模型研究，但数量相对较少。目前，血管性痴呆模型的复制采用大鼠为主，因大鼠具有与人类相似度较高的血管分布。同时，大鼠来源经济易得，且易存活，便于进行动物智能测试及电生理检查。因而大鼠是建立脑缺血模型最理想的动物。此外，C57BL/6品系小鼠的应用也较广泛。C57BL/6品系小鼠具有发育不良的Willis环，更容易诱导低灌注模型。

2 血管性痴呆动物模型及其制备方法

根据模型复制的病理机制，血管性痴呆动物模型主要分为慢性脑低灌注动物模型、慢性脑低灌注混合模型、局灶性脑缺血动物模型、缺血再灌注动物模型。

2.1 慢性脑低灌注动物模型及其制备方法慢性脑低灌注动物模型的复制通常采用双侧颈动脉闭塞法（bilateral carotid artery occlusion，BCAO），主要用于模拟皮层下血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）的发病机制[4]。但BCAO只能揭示VCI单一的发病机制。Tomimoto H等[5]提出慢性脑低灌注通过激活Caspase通路而导致脑白质最先受累，可做为血管性痴呆和脑血管白质病变的模型。研究[6]表明，低灌注可导致内稳态的破坏，包括氧化应激、神经炎症、神经递质系统的功能失调、线粒体功能障碍、脂质代谢障碍和生长因子改变等。双侧颈动脉闭塞可通过两血管阻断法（2-VO）、两血管狭窄法等实现。

2.1.1 两血管阻断法（two-vessel occlusion，2-VO）及其改良永久性结扎双侧颈总动脉（common carotid arteries，CCA）造成慢性脑低灌注状态是目前2-VO的经典模型。最初Wakita H等[7]将2-VO作为可导致继发性白质损伤的脑缺氧模型的建立方法。现2-VO经典模型已被用于研究白质损伤的生理病理学，并被用于探索血管性痴呆的治疗干预措施[8]。Washida K等[9]用“0”号丝线结扎大鼠双侧颈总动脉，使脑皮质和胼胝体的脑血流量（cerebral blood flow，CBF）在术后1~3 d下降到原水平的30%~50%，3 d后脑血流量开始恢复，术后8周至3个月，则基本恢复。Xu C等[10]研究发现，大鼠在BCAO术后14 d，其脑血流量急剧下降，术后21 d恢复正常水平；BCAO术后大鼠出现明显的学习记忆功能障碍，无明显感觉运动功能障碍[11]，这些术后表现有助于血管性痴呆行为学的测试。在慢性脑低灌注状态所致的血管性痴呆动物模型中，各种行为学测试（如Morris水迷宫实验、八臂径向迷宫实验、T型迷宫实验和新型物体识别测试）均表现出认知记忆受损，相比急性期，慢性期的认知损害更严重[9]。组织学研究[12]结果显示，2-VO术后大鼠的海马CA1区神经元固缩，细胞表面积减小，核仁缺失，14 d后出现白质脱髓鞘改变。需要注意的是，由于2-VO术后大鼠的视神经严重损伤，行为学评估应当谨慎。

结扎双侧颈总动脉可造成大鼠严重脑损伤及应激反应，从而导致大鼠死亡率升高。针对此问题，近年来学者不断对2-VO进行改良，以使之更好地适用于临床科研。其中，Sarti C等[13]改良的动物模型具体操作如下：用氟烷麻醉大鼠后，取颈部正中切口，避开甲状腺分离皮下脂肪组织，切断肩胛舌骨肌，在光学显微镜下暴露颈总动脉，用丝线结扎一侧颈总动脉，1周后（郑敏等[14]提出将分次结扎间隔时间设定为3 d）行相同的手术结扎对侧颈总动脉。与传统方法相比，改良后的2-VO阻断法大大降低了大鼠的死亡率，且可造成与传统2-VO法造模所致的大鼠海马区神经元相似的明显变性、坏死和凋亡[15]。在Morris水迷宫的定位航行实验、空间搜索实验中的结果也证实了分次结扎颈总动脉法对动物行为学的影响与传统造模方法比较无显著性差异[16]。

Kitamura A等[17]通过逐渐狭窄的双侧颈总动脉闭塞法（two-vessel gradual occlusion，2VGO）复制出与人类慢性脑灌注不足更相似的动物模型，从而避免了2-VO大鼠急性脑血流量减少和出现急性炎症反应的缺陷。2VGO模型可诱导选择性白质损伤，而神经血管偶联仍相对保留。该模型在术后28 d表现出与2-VO大鼠相似的空间记忆损伤。Tukacs V等[18]发现2VGO适用于长期慢性缺血的模型，且在降低脑血流量方面比双侧颈动脉狭窄法（bilateral carotid artery stenosis，BCAS）效果明显，可应用于观察低灌注对视网膜和视皮层功能的影响。2VGO模型可出现脱髓鞘改变，伴有炎症和神经胶质反应，但无明显的梗死病变或灰质的代谢紊乱。因此，与2-VO比较，该模型更能准确模拟人类缺血性白质改变后的工作记忆损伤。

2.1.2 两血管狭窄法双侧颈动脉狭窄法（BCAS）是通过在颈动脉周围放置部分阻塞的微线圈引起的，线圈的直径可影响阻塞的严重程度。Poh L等[19]认为，0.18 mm线圈在术后2 h内可引起脑血流量减少（与基线水平相比），1~3个月后，脑血流量可恢复到基线水平的80%~85%，而血压未受到影响。Poh L等[20]的另一研究采用专门为小鼠设计的微胶囊（日本Sawane Spring有限公司生产）诱导慢性低灌注模型，发现小鼠术后15、30 d的脑血流量明显减少，证实了小脑凋亡参与慢性低灌注血管性痴呆小鼠的代谢过程，且BCAS诱导的脑血流量下降水平优于大鼠双侧颈动脉闭塞（BCAO）模型。BCAS可诱发脑白质病变，其严重程度与脑灌注不足程度密切相关[21]，因此，BCAS模型主要以空间工作记忆障碍为主。在Morris水迷宫实验、八臂径向迷宫实验中可观察到BCAS模型动物在术后1个月，其空间工作记忆能力下降，在5~6个月后，仍可观察到其广泛的记忆受损。组织学研究[19]显示，BCAS后有广泛的神经元缺失，即在海马CA1、CA2、CA3区可见神经元明显受损；7 d后，CA2、CA3区神经元出现更明显的损伤；8个月后可观察到明显的海马萎缩；甲酚紫和MAP2染色结果显示海马神经元丢失。

2.2 慢性脑低灌注混合模型Torre J C等[22]发现BCAO可使大脑海马区供血减少22%~30%，4周后血流维持稳定。鉴于结扎双侧颈总动脉后Willis环的代偿作用，脑血流下降是短暂的，通过动物腹腔注射硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）、尾动脉放血、颈动脉加压等方法可降低全身血压，减弱Willis环的代偿作用，从而增加造模的成功率和模型的可靠性。

2.2.1 2-VO+腹腔注射硝普钠（SNP）模型王蕊等[23]通过先采用腹腔注射硝普钠（2.5 mg/kg），后采用无创动脉夹结扎双侧颈总动脉的方法创建脑低灌注的动物模型。此法采用腹腔注射硝普钠能降低大鼠血压，减少脑灌注，可抑制Willis环的调节、代偿作用，30 min后大鼠血压恢复到给药前水平。Wei B Y等[24]发现，2-VO+腹腔注射硝普钠模型大鼠的空间学习能力和参考记忆均受损，且空间学习能力受损程度较2-VO大鼠严重。2-VO+硝普钠（2.5 mg/kg）组大鼠认知功能障碍较2-VO+硝普钠（2.0 mg/kg）组大鼠更为稳定，前者可引起更全面的认知障碍。此混合模型主要以学习记忆能力低下为主要特点，无明显运动行为学损伤。术后第7天左右，通过Morris水迷宫实验和跳台实验可观察到学习和记忆功能受损。该模型形态学的变化表现为大鼠海马CA1区细胞线模糊，锥体细胞缺失，细胞数量明显减少；尼氏体染色可见其胞质内尼氏体减少，尤以CA1区最明显。

2.2.2 2-VO+尾动脉放血此方法主要用于复制小鼠VD模型。双侧颈动脉闭塞法加上尾动脉放血可有效复制脑缺血模型，表现为脑低灌注显著，术后小鼠有明显的学习记忆障碍。此外，该法复制的模型可降低实验动物应激所致的高血压。为保证动物的存活，放血量应控制在10%以内，术毕应腹腔注入生理盐水以补充血容量。但此法可增加感染率，同时对动物水迷宫实验会造成一定的影响[25]。

2.2.3 2-VO+Aβ1-42脑室内注射Dai S J等[26]发现双侧颈动脉闭塞法联合脑室内注射β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）可 促 进 大 鼠 阿 尔 兹 海 默 症（Alzheimer’s disease，AD）的发展。Aβ1-42可加速大鼠认知功能的损害，双侧颈动脉闭塞法引起的脑缺血可促进海马CA1区Aβ的产生和锥体细胞的死亡，促进AD的发展。此法为AD伴脑缺血提供了一种耗时更少的模型，故认为，此法可为混合型痴呆提供一种合适的动物模型。

2.2.4 2-VO+双肾双夹（2K2C）法及其改良Lin J等[27]先通过双肾双夹（2K2C）法复制自发性高血压（RHRSP）大鼠模型，在12周后通过尾端血压计测量模型大鼠的收缩压，在此基础上进行双侧颈总动脉闭塞手术（2-VO）；改良后的2-VO则是在结扎一侧颈总动脉1周后进行另一侧结扎。此法可导致广泛的脑白质病变，与RHRSP大鼠相比，RHRSP+改良2-VO大鼠在术后12周均表现出更高的稳定性和更广泛的白质损伤，但死亡率无明显增加。Morris水迷宫实验发现RHRSP+2-VO组及RHRSP+2-VO改良组存在空间认知障碍，且RHRSP+2-VO改良组逃避潜伏期明显高于RHRSP+2-VO组。组织学研究结果显示，RHRSP+改良2-VO组和RHRSP组术后8周和12周均出现明显脱髓鞘、空泡形成、神经纤维消失等表现。Flores G等[28]认为此模型所表现的长程和短程连通性不足可能是导致其认知障碍的重要原因。该模型可以更精确地模拟小血管的病理变化。但这个模型有一个固有的局限性，即不能忽视的遗传因素在RHRSP模型中发挥的作用。

2.3 局灶性脑缺血模型局灶性脑缺血模型模拟了人类永久性脑梗死的病理生理过程，梗死灶固定，重复性好，可模拟关键部位梗死导致的血管性痴呆。其缺点是该模型在梗死部位、梗死体积和病变严重程度等方面均与人类脑卒中存在差异，且动物术后可能出现严重偏瘫症状，从而影响其行为学的检测。

2.3.1 大脑中动脉梗死法赵玲、尹军祥等[29-30]采用大鼠麻醉后开颅暴露大脑中动脉（MCA），将蘸有氯化铁溶液的滤纸敷在MCA上，待MCA变黑，取下滤纸，缝合伤口；蔡晶等[31]采用电凝器热凝固MCA主干；尹军祥等[30]将尼龙线从颈内动脉插入后实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血，2 h后向外提拉线头使大脑中动脉再灌注，复制大脑中动脉梗死线栓模型。大脑中动脉梗死法所致的脑缺血效果可靠，MCA供血区有典型的神经细胞缺血、梗死灶，模型动物有明显的学习记忆障碍，缺血灶明确、可重复性强，但本法操作技巧性要求高，对大鼠造成的创伤较大，死亡率较高。

2.3.2 多发性脑梗死栓塞法赵小贞等[32]通过颅外安置小磁铁吸附经大鼠尾静脉注射的四氧化三铁法实施多发性脑梗死栓塞法，术后大鼠活动能力低下，自发运动减少，多数于24 min后恢复正常。与双侧颈动脉闭塞法相比，此法导致了更严重的学习记忆障碍，组织形态学显示海马CA1区锥体细胞数量减少甚至脱失。此法操作简单，创伤少，重复性好，模型时间周期短，在大脑皮层及海马区域可见相应梗死、软化灶，能较好地模拟人类多发性脑梗死。此外，国内还有其他实施血管内栓塞导致血管性痴呆的造模方法，如左心室注射液体石蜡模型、舌下静脉注入铁粉模型线栓法等。

2.4 缺血再灌注动物模型缺血再灌注动物模型主要用于模拟临床血管再通性损伤及短暂性脑缺血发作等研究。缺血再灌注损伤机制包括自由基的生成、兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载等多种因素。该模型的再灌注损伤明显，脑血流量可见明显下降，可较好地模拟人类再灌注损伤，但该模型的稳定性有待进一步研究。

Liu H等[33]用尼龙线通过颈内动脉进入大脑中动脉，阻断90 min后缓慢抽出，使缺血脑组织再灌注，并按照Poh L等[20]的方法对实验前后大鼠的神经功能进行评定，通过水迷宫实验及跳台实验评价大鼠的认知功能。Chen C Y等[34]通过阻断右侧大脑中动脉和右颈总动脉血流，缺血一段时间后恢复血流，建立双血管闭塞小鼠脑缺血再灌注模型。Khan S等[35]用微细丝阻断血管，间隔不同时间后予以再通，发现缺血时间短于10 min很难产生缺血性脑损伤，即使在7 d之后也如此。大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型可诱发稳定大小的梗死，产生高度可重复性的皮层梗死和行为缺损，与双血管闭塞引起的梗死体积无显著性差异；在降压实验、Morris水迷宫实验中，该模型大鼠可表现出明显的学习记忆障碍；Nissl染色后，可观察到MCAO再灌注大鼠海马皮层及海马CA1区出现明显的神经元缺失，突触表达相关蛋白含量也明显降低。

各类血管性痴呆动物模型的造模方法、特点及临床应用比较见表1。

表1 各类血管性痴呆动物模型的比较Table 1 Comparison of the vascular dementia models estalished by various methods

3 结语

综上所述，血管性痴呆动物模型制备方法近年来已得到较大发展。血管性痴呆动物模型因制备方法的不同，其病理组织学改变和认知功能损害程度也有所不同，存在各自的优缺点，研究者需针对血管性痴呆的亚型和研究目标做出相应的选择。目前，中医药干预血管性痴呆仍普遍采用西医模型的制作方法，评价指标大部分也未涉及中医证候评定。在今后构建中医复合模型方面，可通过手术、药物、高龄等造成肾精亏虚；通过过劳或摄入不足造成气虚模型；通过高脂饮食构建痰浊阻窍型模型；通过2-VO联合高血压病或自发性高血压病大鼠构建肝阳上亢型模型。但中医体质的形成是多种因素长期作用下的结果，临床实验动物造模时间普遍较短，大部分动物模型与中医证候的吻合程度较低，例如腰膝酸软、头晕耳鸣、舌脉、二便等证候指标难以定量，亦缺乏一定的量化指标，在一定程度上限制了中医复合模型的发展。因此，深入量化动物模型的中医考核指标，结合爪甲、饮食、行为学观察，建立一种指标稳定、模型重复率高的可量化模型是中医复合模型未来发展的重点。