3株芽孢杆菌的分离鉴定及其促生效果研究

郭 真，陈倩倩，陆 星，田 江，彭桂香，梁翠月

(华南农业大学资源环境学院/根系生物学研究中心，广东广州 510642)

随着人口的增加，人们对农产品安全及产量的需求也逐渐加大。化肥作为农业生产的基础，在促进粮食增产方面起着至关重要的作用，但近几十年来肥料的过量施用已导致我国农业投入产出比明显降低，甚至造成农业生态环境的严重污染。为了维持农业的可持续发展，人们对新型农用肥料的需求呈上升趋势。而微生物在土壤改良和农作物增产等方面的重要作用已逐渐为人们所认识。目前，利用促生菌、根瘤菌、菌根真菌等有益微生物作为主体的新兴微生物肥料，已在农业生产上得到广泛应用，在推动我国绿色农业方面发挥不可估量的作用。

其中，促生菌(plant growth-promoting bacteria，PGPB)是一类通过复杂的直接或间接机制促进植物生长发育、防治病虫害的一类微生物，促生菌在农业生产上能够活化土壤养分，帮助作物抵御疾病，促进作物的生长繁殖，其作用机理主要包括调节植物激素(如产ACC脱氨酶、分泌吲哚乙酸、赤霉素等)，活化土壤养分(溶磷、解钾以及固氮)，调控次生代谢物的释放以及病原体的防治等。目前发现芽孢杆菌、青霉菌、假单孢菌及根瘤菌属等均有促进植物生长的作用。其中芽孢杆菌在农业生产上是利用较多的一类促生菌。Azaroual等研究发现，在小麦根际接种2种不同的芽孢杆菌，均能有效溶解土壤中的难溶性磷，提高了小麦对磷的利用，从而促进其生长发育。刘鲁峰等发现在根际接种内生枯草芽孢杆菌后，甘蔗的根系长度、活力和生物量等指标均显著高于不接种对照 。这些研究表明，某些芽孢杆菌能够显著促进植物生长，且其对植物的促生作用机理不同。因此，解析芽孢杆菌促进植物生长的机理对于充分利用芽孢杆菌资源具有重要指导意义。

20世纪80年代以来，我国微生物肥料产业发展迅速，规模逐渐增加，工业化及生产水平不断提高，推广应用范围也在逐步扩大，但也存在如微生物资源保存数量不足、机理研究工作不充分、有益微生物开发利用率低等问题。因此，笔者从不同土壤筛选出3株芽孢杆菌，研究这3株菌株的促生和解磷功能，为农用微生物肥料的开发提供重要的菌种资源。

1 材料与方法

从广东省湛江市(32°98′48.46″E、114°35′44.05″N)水稻土中分离了一株芽孢杆菌，将其命名为RL1；从贵州省兴义市(104°54′13.02″ E、24°58′17.44″ N)大豆根际土壤中分离了2株芽孢杆菌，分别命名为Y26和P90。

挑取单克隆于装有液体LB培养基的2 mL离心管中，在摇床中28 ℃ 180 r/min培养至对数生长期，吸取2 L菌液于LB固体培养基，培养箱中28 ℃下培养，并分别在24、48、72 h对其拍照。

将目标菌株活化后，挑取单克隆，用无菌水将其稀释成菌悬液备用。吸取10 L菌悬液滴将其固定在洁净的载玻片中央，在干燥后的菌膜上滴加结晶紫染色液，染色1 min后，用无菌水清洗多余的染色液；然后滴加碘液染色1 min，再用清水清洗多余染色液；加95%乙醇，摇动玻片脱色20～60 s，吸去多余水分，滴加番红染液复染1 min，用水清洗，吸去多余水分，用油镜观察菌体颜色及形态。

微生物DNA的提取按照细菌DNA提取试剂盒所示方法提取(Omega D3350 Bacterial DNA Kit)。以上述步骤提取的DNA为模板，用PCR反应引物进行扩增。上游引物序列：5′-GTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物序列：5′-TACGGYTACCTT GTT ACGACTT -3′。PCR反应条件：94 ℃保持3 min；94 ℃ 0.5 min，54 ℃ 0.5 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃保持7 min。

取5 μL PCR产物到 1%琼脂糖凝胶上电泳约20 min，将清晰条带送至天一辉远生物科技有限公司(广州)测序，所得序列在NCBI blast(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和LPSN基因库(https：//bacterio.net/)数据库中进行核苷酸序列比对，获得其同源性较高的序列，然后用MEGA 5.2软件对这些序列进行分析，并构建系统发育树。

对菌株的解磷能力进行了定性和定量测定。定性试验：活化目标菌株后，挑取单克隆于1 mL液体LB培养基，在摇床中28 ℃、180 r/min培养至对数生长期，用移液枪吸取2 μL不同浓度(1、10、10和10)菌液于无机磷固体培养基，在28 ℃培养21 d后拍照观察溶磷圈。定量试验：吸取1%的菌液在50 mL无机磷培养基中，28 ℃、180 r/min培养21 d，每3 d吸取2 mL含菌液的液体培养基，5 000 r/min离心3 min，取上清液用钼蓝比色法测定可溶性磷含量。对照试验CK为不加菌液的处理，每个处理设4个重复。

对菌株的产酸能力进行了定性和定量测定。在定性试验中，取单克隆接种于1 mL 液体LB培养基中，28 ℃、180 r/min培养至对数生长期，将其稀释4个倍数(1、10、10、10)，并吸取2 μL不同浓度的菌液于固体PVK改良培养基表面，在28 ℃中培养4、5和6 d后拍照。定量试验中，取单克隆接种于1 mL液体LB培养基，28 ℃、180 r/min培养至对数生长期，吸取1%的菌液接种于50 mL无机磷培养基，28 ℃、180 r/min培养15 d，每3 d吸取2 mL的上清液，测定pH。对照试验CK为不加菌液的处理，每个处理4个重复。

挑取单克隆接种于1 mL液体LB培养基，在摇床中28 ℃、180 r/min培养至对数生长期后，吸取1%的菌液接种至50 mL King液体培养基中，28 ℃、180 r/min培养9 d，吸取菌液，5 000 r/min离心3 min，取1 mL上清液于2 mL离心管，并加入1 mL的salkowski比色液，在黑暗中静置30 min，在530 nm波长下测定吸光值。以纯吲哚-3-乙酸制作标准曲线，计算培养基中的吲哚-3-乙酸含量。对照试验CK为不加菌液的处理，每个处理4个重复。

对菌株进行淀粉水解能力和3-酮基乳糖反应等性质的鉴定。在淀粉水解能力鉴定试验中，吸取2 μL菌液接种于可溶性淀粉固体培养基，28 ℃恒温培养箱中培养3 d，在培养基平板上滴加2 mL碘液，观察菌落周围颜色。3-酮基乳糖反应试验中，吸取2 μL菌液接种于乳糖酵母固体培养基，28 ℃恒温培养箱中培养3 d后加入本尼迪克特试剂，于室温下放置1 h，观察菌株周围的黄色或砖红色氧化亚铜沉淀。

采用泥炭土培养方法，以大豆基因型YC03-3为植物材料，在正常磷和钙磷条件下设置促生菌添加试验和对照试验，每个处理设置5个重复。其中，正常磷处理以磷酸二氢钾为磷源，钙磷处理以磷酸三钙为磷源，磷浓度均为0.03 mg/g(磷酸二氢钾和磷酸三钙以基肥施入)。

将基质和蛭石按照3∶1重量混匀，添加Hogland’s无磷营养液(pH 5.8)至湿润状态，充分混匀，装盆。挑选大小一致的大豆种子，氯气熏蒸法灭菌后，每盆播种3颗种子，播种7 d后间苗，每盆保证1棵植株，种植期间依据基质干湿程度定量浇蒸馏水，每3 d等量浇一次Hogland’s无磷营养液。将目标芽孢杆菌接种于液体LB培养基中，28 ℃、180 r/min培养至OD值0.6，5 000 r/min离心5 min后，用无菌Hogland’s无磷营养液重悬制成菌剂。种子萌发3、7和10 d后，每盆接种100 mL菌剂，种子萌发30 d后收样。测定大豆干重、根表面积、总根长和磷含量。

试验数据由Microsoft Excel 2019录入，采用SPSS、Original 8.0等软件对所有数据进行统计分析。

2 结果与分析

将3株芽孢杆菌接种于固体LB培养基上，于24、48 和72 h对菌株形态进行观察(图1)和鉴定(表1)发现，3株菌的菌落形态和菌落扩张速度不同。其中，RL1菌落表面粗糙干燥，扁平，为乳白色；Y26菌落表面粗糙干燥，凸起，淡黄色；P90菌落表面平滑黏稠，凸起，浅黄色。通过革兰氏染色法染色及光学显微镜观察菌体形态，各菌株染色结果均为紫色，形状均为杆状，具有运动性，能够产生芽孢。

对3株芽孢杆菌16S rRNA 基因进行 PCR 扩增并测序，根据16S rRNA核苷酸序列在NCBI blast(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和LPSN(https：//bacterio.net/)数据库中进行比对分析，RL1(登录号：MW836813)和Y26(登录号：MW836139)菌株与沙佛芽孢杆菌()的相似性为100%，P90(登录号：MW836683)与阿氏芽孢杆菌()的相似性为100%(表2)。

将4株芽孢杆菌的16S rRNA基因序列比对分析结果使用MEGA软件构建系统发育树，结果见图2。

3株芽孢杆菌分别接种在PKO固体和液体培养基上生长至21 d。固体培养试验结果显示，这3个菌株均能够分解PKO固体培养基中的磷酸三钙，并形成透明的溶磷圈(图3A)。液体培养结果显示，与不接种对照中的可溶性磷浓度无明显变化相比，接种3株菌株的培养液中的可溶性磷含量随培养时间的延长而持续升高，且培养21 d后，菌株RL1培养液中的可溶性磷浓度显著高于P90和Y26(图3B)。

图1 3株芽孢杆菌菌落形态Fig.1 Colony morphology of the three Bacillus strains

表1 3株芽孢杆菌菌落形态特征及菌体特征

表2 3株芽孢杆菌16S rRNA 序列比对结果

通过固体和液体培养2种方法检测了3个菌株的泌氢能力。其中，将菌株接种在PVK改良固体培养基上1 d后，菌株周围呈明显黄色，且随时间推移，菌落周围的黄色逐渐加深，说明3株菌株均能分泌质子酸化周围环境(图4A)。在PKO培养液中接种3株菌株，其pH检测结果显示，接种3 d后培养基的pH由7.0下降至4.5～5.5，但3个菌株培养液的pH无明显差异，且3 d后培养液的pH无明显变化(图4B)。

图2 基于 16S rRNA 基因序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

注：A.芽孢杆菌的解磷效果，4个菌斑为该微生物的4种浓度，左上、右上、左下、右下浓度依次为1、10-1、10-10、10-100；B.芽孢杆菌的解磷量，“***”表示芽孢杆菌溶解磷酸三钙的量与对照组相比差异极显著(P<0.001) Note：A.Determination of phosphorus solubility.The four plaque concentrations in the figure are 1,10-1，10-10 and 10-100(similarly hereinafter)；B.Phosphate solubilization capacity of the three Bacillus strains，“***” indicates significant statistical differences(P < 0.001)图3 3株解磷菌株对难溶性钙磷的溶解能力Fig.3 Capacity of three Bacillus strains in the mobilization of sparingly soluble Ca3(PO4)2(Ca-P)

注：A.3株芽孢杆菌的泌H+效果；B.接种3株芽孢杆菌对培养液pH的影响 Note： A.Ability of H+ secretion of the three Bacillus strains；B.The effects of three Bacillus strains on pH value in the growth medium图4 3株芽孢杆菌泌氢能力Fig.4 Capability of three Bacillus strains in H+ secretion

进一步分析了这3株芽孢杆菌的淀粉水解、3-酮基乳糖氧化及产吲哚-3-乙酸能力。其中，在含可溶性淀粉的固体培养基中P90菌落周围为明显黄色，说明P90具有淀粉水解能力，而RL1和Y26菌落周围无明显黄色，说明这2个菌株不具备淀粉水解能力(图5A)。在含有3-酮基乳糖的固体培养基中，3株芽孢杆菌均不能将培养基氧化成红色，说明这3个菌株均不具有氧化乳糖的能力(图5B)。

在液体King培养基中培养这3株促生菌，9 d后测定培养基中的吲哚-3-乙酸含量，菌株RL1、Y26和P90均具有分泌吲哚-3-乙酸的能力，且分泌量分别为15.21、12.40和15.40 mg/L(图5C)。

接种3株芽孢杆菌均显著促进了大豆植株的生长(图6A)。与不接种对照相比，正常磷条件下(HP)接种RL1、Y26和P90的大豆植株地上部干重分别增加了68.32%、50.14%和32.39%(图6B)，根系干重分别增加了40.38%、19.23%和27.89%(图6C)，总根长分别提高了43.78%、24.55%和43.94%(图6D)，根表面积分别提高了42.28%、28.76%和57.05%(图6E)，地上部磷含量分别增加了48.29%、9.50%和18.30%(图6F)，而根系磷含量分别增加了57.33%、26.56%和37.51%(图6G)。

注：A.3株芽孢杆菌的淀粉水解效果；B.3株芽孢杆菌的3-酮基乳糖氧化效果；C.3株芽孢杆菌培养9 d后，培养液中吲哚-3-乙酸含量。“***”表示芽孢杆菌分泌吲哚-3-乙酸量与对照相比差异极显著(P<0.001) Note：A.Starch hydrolysis ability of the three Bacillus strains；B.3-keto lactose oxidation of the three Bacillus strains；C.The concentration of IAA produced by the three Bacillus strains for 9 days，“***” indicates significant statistical difference(P < 0.001)图5 3株芽孢杆菌的淀粉水解、3-酮基乳糖氧化及产吲哚-3-乙酸能力Fig.5 The ability of starch hydrolysis,3-keto-lactose oxidation and indole-3-acetic acid production of three Bacillus strains

注：A.大豆植株表型；B.植株地上部干重；C.植株根系干重；D.植株根系总根长；E.植株根表面积；F.植株地上部磷含量；G.植株根系磷含量。*表示接种芽孢杆菌与不接种对照处理相比差异显著(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。标尺为20 cm Note：A.Soybean phenotypes；B.Shoot dry weight；C.Root dry weight；D.Total root length；E.Root surface area；F.Phosphorus content of shoot；F. Phosphorus content of root.* indicated significant difference between inoculation and non-inoculation(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001).Bar=20 cm图6 3株芽孢杆菌对大豆生长发育的影响Fig.6 Effects of three Bacillus strains on soybean growth

与高磷处理相似，泥炭土中添加磷酸三钙(CaP)作为唯一磷源时，接种RL1、Y26和P90的大豆植株与不接种对照相比，其地上部干重分别提高了46.02%、61.93%和64.2%(图7B)，根系干重分别提高了10.71%、39.29%和48.21%(图7C)，总根长分别提高了5.56%、31.08%和31.35%(图7D)，根表面积分别提高了10.05%、42.02%和42.52%(图7E)，地上部磷含量分别增加了27.49%、40.39%和39.77%(图7F)，而根系磷含量分别增加了28.34%、72.56%和73.62%(图7G)。

3 结论与讨论

微生物肥料能够活化土壤养分、改善土壤理化性质、防治土壤有害微生物、促进作物生长及改善作物品质等，因此其越来越广泛地应用于农业生产。微生物肥料的重要组成成分是有益功能菌。其中，促生菌定殖于植物根部，通过一系列生理生化活动，提高植物对生物及非生物胁迫的耐受性，改善植物对土壤养分的吸收利用，促进作物的生长发育。鉴于微生物在农业生产上独特的社会和经济价值，加强对微生物资源的开发利用与保护，具有极其重要的意义。

微生物种群结构的变化受多种因素的驱动，其中包括气候、土壤理化性质、海拔、生态类型和人为活动等。我国西南喀斯特地区石漠化较为严重，植物种类、植被盖度和土壤肥力均受石漠化的制约。而土壤微生物可直接参与土壤的物质循环和能量转化，促进石漠化地区植物养分的吸收。此外，广东省湛江市位于亚热带沿海地区，土壤类型以滨海盐土和酸性土壤为主，是华南地区主要的粮食产地之一。但在酸性土壤中，磷极易被固定，导致土壤的磷有效性降低。这些特殊的地理环境，很可能孕育出具有特殊性质或新基因的微生物。因此，分离适应当地土壤及气候条件的优良菌株将对菌肥的开发和利用、维持当地农业生产的可持续发展具有重要意义。因此，该研究选取贵州省兴义市石漠化土壤，及广东省湛江市水稻土作为研究对象，从中分别筛选出3株不同种类的芽孢杆菌。通过16S rRNA基因序列比对分析发现RL1和Y26属于沙佛芽孢杆菌();P90属于阿氏芽孢杆菌()。这3株菌株虽然来自不同类型的土壤，但均具有溶解磷酸三钙、泌氢和产生吲哚-3-乙酸的能力，而P90还具有水解淀粉的能力。这与其他已报道的芽孢杆菌的生理生化特性类似。如柴晓虹等对12株不同种属的促生菌进行评价，其中蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌具有不同程度的产酸、产吲哚-3-乙酸、淀粉水解以及其他功能。烟草植株根围土壤中筛选出的巨大芽孢杆菌也具有较强的解磷和淀粉水解能力等。

芽孢杆菌所具有的分泌吲哚-3-乙酸和水解难溶磷的能力在农业生产中具有重要应用价值。郑文波等在江西红壤花生地中发现1株巨大芽孢杆菌()，该菌株具有分泌吲哚-3-乙酸和解磷能力，接种该菌株后，花生植株全磷含量、根长、根尖数、根表面积及根体积均显著增加。另外，河北冀微生物肥料有限公司研发的冀微菌肥以枯草芽孢杆菌为主体，其具有分泌吲哚-3-乙酸、解磷及解钾等能力，该菌肥应用于结球白菜能够显著改善作物产量和品质。为了验证该研究所分离的3株芽孢杆菌的解磷和分泌吲哚-3-乙酸的特性是否能够促进植物生长，设计了正常磷处理和钙磷2种处理，比较了接种和不接种条件下，大豆的生物量、根系性状和磷含量。结果显示，接种3株芽孢杆菌后，大豆的干重、总根长、根表面积及全磷含量与对照相比均显著提高。这说明该研究所筛选的3株芽孢杆菌均能够改变大豆的根系构型，提高植株利用外源难溶磷的能力。

综上所述，该研究筛选的3株芽孢杆菌具有解磷、泌氢和产吲哚-3-乙酸的能力。在大豆盆栽试验中，接种这3个菌株均能够不同程度提高大豆的干重、总根长、根表面积和磷含量。虽然这3个菌株在离体培养条件下其解磷、泌氢和产吲哚-3-乙酸的能力无明显差别，但接种不同菌种对大豆植株的促生效果不同，原因可能与其在植物根部的定殖效果、温度、营养来源及作物种类等有关。虽然这3个菌株的具体促生机制还有待进一步研究，但大豆盆栽试验结果表明，所筛选的菌株可作为一种高效的备选菌株，为微生物肥料的发展提供菌种资源。