湖光岩风景区耐高温微生物多样性分析及产酶特性研究

赖崇熙，刘唤明，唐金燕

(广东海洋大学食品科技学院，广东省现代农业科技创新中心，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东湛江 524088)

耐高温微生物是一类最适生长温度大于50 ℃微生物的总称，其通常分布在地质结构活跃的酸性硫磺区、淡水温泉和间歇喷泉深海火山口等。虽然目前耐高温菌株的探究并不多，但是在实际的工业生产中已经有各种各样的研究应用，例如詹亚斌等运用耐高温油脂降解菌株降解厨余垃圾，加快堆肥腐熟的过程；刘辉等用耐高温的酿酒酵母进行酿酒，提高乙醇的生产效率，降低成本，提高乙醇的稳定性；侯世杰利用耐高温复合菌剂对有机废弃物进行堆肥处理，实现废弃物的资源化回收；温俊丽研究发现新的高温产电厚壁菌门细菌为高温燃料电池的研发提供了新的思路；Seesatat等用嗜热木质纤维素分解菌对稻秆进行发酵并且在15 d达到了产甲烷和沼气的最大值；Liu等研究发现嗜热细菌+ 0.2 g/g VSS烷基聚葡萄糖可以有效降解海洋养殖中产生的废弃物等。耐高温微生物与常规的微生物相比存在极大的优势，耐高温的特性使其在发酵工业、废水处理、工业生产等方面都有广泛的应用前景。耐高温微生物产生的酶系具有催化效率高、对反应冷却系统要求低、热稳定性强、节约能源、专一性强等特点，这些优点使得耐高温酶系一度成为人们的研究热点，其中以蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶尤为突出。Darwesh等使用G550菌株产生的耐高温碱性蛋白酶作为生物防治剂抑制线虫的繁殖；Liu等使用耐高温的纤维素酶发酵生产生物乙醇并且生产率达0.112 g/g干物底；Vaikundamoorthy等研究表明海洋细菌蜡样芽孢杆菌产生的耐高温淀粉酶对海洋生物膜形成的细菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌表现出良好的抗生物膜活性，具有成为良好抗菌剂的潜力。这些都表明耐高温的微生物及其酶系已经成为人们的研究热点，但是目前所发现的耐高温的微生物及其酶系并不多，需要人们不断地探索，才能满足人们的生产以及科研的要求。

湖光岩坐落于我国大陆南端，具有特殊的玛珥火山地貌，是世界两大玛珥湖之一。玛珥湖是由于火山爆发导致底层塌陷形成盆地，而火山的喷发物在附近形成“围墙”将其与周围环境分隔开，盆地形成积水最后变成湖。也正是如此使得湖光岩玛珥湖可以记录下其气候的变化、季风的演变，而其土壤和湖水中很好地保存了各种各样的古细菌、耐高温菌、甲烷微菌、藻类、浮游植物等。湖光岩的特殊地貌使得在这里生长的微生物与其他地区的微生物存在一定程度上的差别，有的学者也进行了关于湖光岩的微生物的多样性研究，但是目前鲜见湖光岩耐高温微生物相关方面的研究。因此该研究通过对湖光岩耐高温微生物的多样性分析以及产酶特性的研究，为湖光岩的菌株开发利用提供参考，为耐高温微生物以及耐高温酶的丰富发展提供助力。

1 材料与方法

试材。土壤样品，取自湛江市湖光岩风景区10 cm以下；革兰氏染色液试剂盒，北京陆桥技术股份有限公司；2×MightyAmp Buffer Ver.2、MightyAmp DNA 聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司；16S rRNA 细菌通用引物1492R、16S rRNA 细菌通用引物27F、DL 2000 DNA Marker、ddHO， 生工生物工程(上海)股份有限公司；核酸染色液，北京索莱宝科技有限公司；6×loading buffer、琼脂糖，广州艾基生物技术有限公司。

培养基。羟甲基纤维素纳培养基，参考张进良的方法，即NaCl 6 g、CaCl0.1 g、MgSO·7HO 0.1 g、KHPO0.5 g、KHPO2 g、(NH)SO2 g、CMC-Na(羧甲基纤维素钠)10 g、琼脂15 g,蒸馏水1 000 mL。脱脂牛奶培养基：脱脂奶粉100 g、琼脂20 g、水1 000 mL，将配好的琼脂和奶粉进行分开灭菌，防止奶粉发生变性，琼脂121 ℃灭菌20 min，脱脂奶粉100 ℃,5 min。可溶性淀粉培养基：可溶性淀粉20 g、KNO1 g、NaCl 0.5 g、KHPO0.5 g、MgSO0.5 g、FeSO10 mg、琼脂20 g，水1 000 mL。营养琼脂：琼脂20.0 g、牛肉膏 3.0 g、氯化钠 5.0 g、蛋白胨10.0 g。

仪器。AUY220 电子天平，日本岛津企业管理(中国)有限公司；SW-CI-2F 洁净工作台、BXP-280S 微生物培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；A300 梯度PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；LS-B50L 立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；H6-1 微型电泳槽，上海精益电器厂有限公司；DYY-8C 电泳仪，北京六一生物科技有限公司；JY3002 精密电子天平，上海精密科学仪器有限公司；L1100A 生物显微镜，广州粤显光学仪器有限公司；ZF-20D 暗箱式紫外分析仪，孔义市子华仪器有限责任公司。

湖光岩风景区耐高温微生物的分离纯化。称取10 g的土壤样品加至90 mL的无菌水中，振荡20 min使样品与无菌水充分混匀，配制成10的稀释液。取1 mL的稀释液加至9 mL的无菌水中依次配制成10、10稀释度的稀释液。取分别100 μL的10、10稀释菌液在营养平板上进行涂布分离，将涂布完成的平板在培养箱中正面放置10 min，待菌悬液吸收完全后再倒置进行50 ℃培养24 h，通过此法分离出的菌株为耐高温微生物。挑取涂布平板内菌落特征不一样的菌落用四分法划线于营养琼脂平板内，对菌株进行多次纯化直到分出单个菌落为止，并且制作成斜面进行菌种保藏。

耐高温菌株的鉴定。

形态学鉴定。从分离出的耐高温微生物菌种斜面上取一环菌株在营养琼脂上进行划线，在50 ℃恒温培养箱培养48 h，观察并且记录菌株的菌落形态，通过革兰氏染色进行制片，然后用显微镜进行观察，记录染色结果。

分子生物学鉴定。采用16S rRNA进行鉴定，对分离出的菌株进行划线，得到单菌落，采用细菌的DNA作为模板，用通用引物27F(- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -)和1492R(- GGTTACCTTGTTACGACTT -)进行PCR扩增。PCR反应体系30 μL：2×MightyAmp buffer 15.00 μL，MightyAmp DNA聚合酶0.75 μL，引物27F(10 μmol/μL) 0.75 μL，引物1492R(10 μmol/μL) 0.75 μL，ddHO 12.75 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸90 s，进行40个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应保存。取4 μL的PCR扩增产物与1 μL的6×loading buffer混合在1%的凝胶中电泳，将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列检测。将检测结果与EzBioCloud和NCBI中的碱基序列数据进行Blast对比，搜索出同源相关性最高的标准参考序列，对其构建系统发育树并且进行多样性分析。

产酶能力测定。

产蛋白酶能力。将筛选出的菌株挑取单菌落于脱脂奶粉平板上，50 ℃培养24 h，水解圈越大，产酶能力越强。

产淀粉酶能力。将筛选出的菌株挑取单菌落于可溶性淀粉平板上，50 ℃培养24 h，滴加卢戈氏碘液观察水解圈大小，水解圈越大，产酶能力越强。

产纤维素酶能力。将筛选出的菌株挑取单菌落于羧甲基纤维素钠平板上，50 ℃培养5 d，加入1%刚果红溶液，使刚果红溶液覆盖整个平板等待15 min左右，用1 mol/L氯化钠溶液洗去刚果红溶液，观察水解圈大小，水解圈越大，产酶能力越强。

2 结果与分析

从湖光岩的土壤样品中，通过高温培养分离出10株细菌，编号为S～S，对其进行纯化，根据菌落的颜色、菌落的形态特征、菌落的干湿黏稠特征、菌落的大小、边缘分布特征、有无光圈等记录其菌落特征，结果如表1所示。其中S和S菌株表现出淡黄色，其余8株均为白色；细菌形态为圆形的共有7株，分别为S、S、S、S、S、S、S，剩余的S为不规则形状，S为点状，S为线状；只有S菌株不易挑起；只有S和S菌株边缘不完整，其中S边缘呈不规则，S边缘呈啮蚀状；只有S菌株表面不光滑；所有菌株都没有光泽。

经革兰氏染色以及镜检检测，10株有耐高温特点的菌株有一株为革兰氏阴性菌，编号为S，其余9株均为革兰氏阳性菌。10株菌株的形态全部呈杆状，其中，S、S为长杆菌，其余8株为短杆菌。

将10株耐高温菌株进行16S rRNA序列检测，采用NCBI、EZBioCloud、GenBank等公共数据库进行相似性搜索，把与检测出的基因序列相似性较高的已取得证书的模式菌株的基因序列下载下来，对它们的类别进行区分以及统计它们之间的相似性，结果见表2。从表2可以看出，这10株细菌被分为3个类群，S、S、S、S、S、S、S为芽孢杆菌()类群，而S、S为短芽孢杆菌()类群，S为解脲芽孢杆菌()类群。其中属的菌株有7株，占耐高温菌株的70%，占绝对优势，属于优势菌群。

表1 耐高温菌株的菌落形态

表2 所筛选细菌与其系统发育关系最为密切的典型菌株之间的系统发育关系

把送检得出的样品的基因序列与相似性较高的已取得证书的模式菌株的基因序列采用MEGA 7.0进行系统发育树的构建，结果见图1。从图1可以看出，这10株菌株均与不同的典型菌株聚在一起，再结合表2细菌序列比对结果，这些从湖光岩风景区筛选出的有50 ℃耐高温特性的菌株与其相关的已知物种的典型菌株的16S rDNA基因序列相似性在98.6%～99.8%，说明这些菌株由湖光岩风景区筛选出的有50 ℃ 耐高温特性的菌株与其系统发育关系最密切的相关菌株之间存在不同程度的遗传差异。

由表3可知，有4株菌株具有产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力，其中菌株S的产酶能力最强，这些菌株将在工业生产中有巨大的应用前景。菌株S只具备产蛋白酶的能力，有5株菌株均不具有产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的能力。

图1 依据16S rRNA序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA sequence

3 讨论与结论

微生物具有生长范围广、繁殖快等特点，因此微生物制剂被广泛应用于农业、工业、食品以及医学与生物技术领域。但是随着工业的发展，人们对于生产效率的要求不断提高，酶制剂就出现在人们的眼前，通过微生物的发酵产生大量的生物酶再将其分离制作成酶制剂，酶制剂具有微量高效、专一性强、节能环保、绿色无毒、反应条件温和的优点，这使得其在基础研究、医药、养殖、日常生活、环保、饲料工业、皮革工业、食品领域得到了广泛的应用。

酶制剂在实际生产中往往是以一种或几种单一酶制剂为主体,与其他单一酶制剂混合而成的，这样使得复合酶制剂的生产和应用变得比较烦琐。蛋白酶在洗涤剂、皮革、医疗、食品等工业领域有着广泛的应用；纤维素酶被广泛应用在食品、造纸、发酵、纺织、农业、制药、生物燃料等行业；淀粉酶在从食品、饮料、纺织等不同过程中都有出色的应用市场，这些酶的运用领域都是相关联的，因此探究发现能同时产生大量蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的微生物就显得十分有必要，这样就可以直接解决工业上多种酶的需求，节约生产流程和成本。

表3 菌株产酶能力

经过耐高温的分离培养、纯化得到10株耐高温微生物，对其进行16S rRNA鉴定发现其中有7株菌株属于，2株菌株属于，1株属于。通过测定分离菌株的产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶能力可以得知，菌株S的产酶能力最强，能同时产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶，相信该菌株的探索研究能为湖光岩的菌株开发利用提供参考。