枇杷根系对木霉P3.9菌株及枇杷根腐病病菌的生理响应

鲁海菊，熊欣燕，冯 渝，何凤益，戈运康，张廷萍

(红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自，661199)

近年来，云南省蒙自地区枇杷根腐病普遍严重发生，发病率高达40%以上[1]，给当地枇杷特色产业带来毁灭性打击。经本研究团队多年调查研究发现，蒙自枇杷根腐病是由小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsismicrospora引起的一种土传真菌新病害[2]，全世界尚属首次报道。目前，当地防治该病害主要采用化学防治，但化学防治存在有效农药少且价格高，施药困难，容易造成农药残留超标，污染环境等问题，因而未能有效控制枇杷根腐病。另外，由于枇杷对根腐病抗性遗传的复杂性，短期内也难以获得对根腐病免疫的枇杷抗病新品种。因此，我们聚焦有益微生物控制枇杷根腐病的生物防治方法。从枇杷主干韧皮部分离获得的1株内生木霉Trichodermaatroviride菌株 P3.9，已证实能成功抑制枇杷根腐病菌，抑菌率达93%，对枇杷根腐病盆栽防效显著，防效可达80%；且对枇杷植株有促生作用，对枇杷生长无不良影响；此外，还兼具耐药、解磷、降解纤维素、抗菌谱广、发酵工艺简单等多种功能[3]，开发利用前景非常广阔。然而其是否能够诱导枇杷抗病性尚未明确。

诱导抗性是植物受诱导启动自身防御系统，增强对后续病原物的抵抗力。病程相关蛋白(PRP)积累是植物获得诱导抗性的标志之一，病原微生物可以诱导这类蛋白产生[4]。已在烟草等20多种植物中发现病程相关蛋白[5]，且分布于植株所有器官[6]，集中于植物细胞间隙和液泡内[5]。β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶是PRP的代表性蛋白，两者能相互协同降解植物病原真菌细胞壁[7]。链格孢Alternariaalternata侵染诱导抗病甜瓜品种产生大量β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶，能延缓病斑扩展速度[8]。除了病程相关蛋白酶外，植物体内也存在与植株抗性相关的其他酶。过氧化物酶参与细胞活性氧代谢、木质素和木栓质的合成，苯丙氨酸解氨酶参与细胞木质素、植保素和黄酮类物质的合成[9]，纤维素酶可以降解植物病原卵菌细胞壁，植物抗感病品种中淀粉酶活性存在差异，上述酶均在植物抗性中发挥作用。已有大量研究表明，诱导植物抗病性是内生木霉生防机制十分重要的方面[10]。因此，为明确枇杷内生木霉菌株P3.9是否诱导枇杷抗病性，本文从生理生化角度研究枇杷根系接种后诱导抗病性相关酶活性变化规律，为今后枇杷内生木霉P3.9菌剂的系统开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

“大五星”枇杷苗，由蒙自市十里铺枇杷育苗基地提供。内生木霉Trichodermaatroviride菌株P3.9、枇杷根腐病菌Pestalotiopsismicrospora菌株P3.1、P3.5和P3.6保存于红河学院植物病理学标本室。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖17 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000mL，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌种扩繁 将木霉菌株P3.9、枇杷根腐病菌菌株P3.1、P3.5及P3.6接种到PDA培养基上，置于28 ℃培养箱中培养观察，等到平板上长出孢子后即可取出备用。

1.2.2 木霉菌剂的制备 分别称量米糠10.0 g、果糖0.2 g、自来水7.0 mL，混匀放入组培瓶，同样的方法组培瓶准备60个。这些组培瓶，三角瓶装自来水250 mL，100 mL小烧杯2个，及1.5 mL注射器采用高压蒸汽灭菌法灭菌冷却备用。将培养基上的木霉孢子用蒸馏水洗到小烧杯中，稀释调节孢子浓度为107个/mL，取1 mL接种到组培瓶中，置于28 ℃培养箱中视木霉生长情况培养5～7 d后，调节木霉孢子浓度为106个/mL备用。

1.2.3 枇杷苗种植及菌剂接种方法 枇杷嫁接苗种植于营养袋(23 cm×18 cm)中，枇杷基地土壤未消毒用作陆地盆栽，苗龄1年时做接种试验。用上述木霉菌剂20 g/株拌土施入根部；用直径5 mm打孔器取病原菌菌片，用相同直径的打孔器去除枇杷苗根茎韧皮部，将菌片正面贴合木质部接种，保鲜膜缠绕保湿，每株接种菌片3个。设置接种枇杷根腐病菌P3.1+内生木霉P3.9菌剂，枇杷根腐病菌P3.5+内生木霉P3.9菌剂，枇杷根腐病菌P3.6+内生木霉P3.9菌剂，内生木霉P3.9菌剂，PDA圆片+灌根等量米糠做为对照等5个处理，重复10次，常规肥水管理。接种7 d后取各处理的枇杷根，重复3次，液氮冷冻，-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 酶活性检测 将上述15个样品用干冰寄送至苏州科铭生物有限公司，用高效液相色谱法分别检测过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、纤维素酶(CL)、几丁质酶(Ch)、β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-GA)、内切β-1，4-葡聚糖酶(β-1，4-Cx)、外切β-1，4-葡聚糖酶(β-1，4-Cl)、α-淀粉酶(α-AL)等8种酶活性。

1.2.5 数据分析 用SPSS 19.0软件，Duncan's多重比较法处理分析数据。

2 结果与分析

2.1 对根部过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性的影响

从表1可以看出，接菌处理的根部过氧化物酶活性与对照差异极显著，其过氧化物酶活性均高于对照，说明木霉菌株P3.9能显著促进枇杷健康植株及根腐病株根部过氧化物酶活性增加。其中，接种根腐病菌P3.5+木霉拌土和木霉拌土处理根部过氧化物酶活性无显著性差异，且活性较高。接种根腐病菌P3.1+木霉拌土、接种根腐病菌P3.6+木霉拌土两个处理的根部过氧化物酶活性在p<0.05水平差异显著，在p<0.01水平差异不显著。说明木霉菌株P3.9对菌株P3.5引起的枇杷根腐病株根部过氧化物酶活性的促进作用最强，其活性与单独接种木霉菌株相当；其次是P3.6和P3.1菌株引起的枇杷根腐病株。

接种根腐病菌+木霉拌土处理与对照的根部苯丙氨酸解氨酶活性差异极显著，其苯丙氨酸解氨酶活性均高于对照，木霉拌土处理与对照差异不显著，说明木霉菌株P3.9能显著促使枇杷根腐病株根部苯丙氨酸解氨酶活性增加。其中，接种根腐病菌P3.1+木霉拌土、接种根腐病菌P3.5+木霉拌土两个处理的根部苯丙氨酸解氨酶活性无显著性差异，且活性较高。说明木霉菌株P3.9对病原菌菌株P3.1和P3.5引起的枇杷根腐病株根部苯丙氨酸解氨酶活性促进作用较强。

2.2 对根部纤维素酶和几丁质酶活性的影响

从表1可以看出，接种根腐病菌+木霉拌土处理与对照的根部纤维素酶活性差异不显著，说明木霉P3.9菌株不影响枇杷根腐病株根部纤维素酶活性。木霉拌土处理与对照差异极显著，说明木霉P3.9菌株能显著促进枇杷健康植株根部纤维素酶活性增强。

接种根腐病菌P3.1+木霉拌土处理与对照的根部几丁质酶活性差异不显著，其余接菌处理与对照差异极显著。说明木霉菌株P3.9能显著促进枇杷健康植株根部几丁质酶活性降低；对根腐病株根部几丁质酶活性的影响表现多样，其中，促使菌株P3.5和P3.6引起的枇杷根腐病株根部几丁质酶活性显著降低，不影响菌株P3.1引起的枇杷根腐病株根部几丁质酶活性。

2.3 对根部葡聚糖酶活性的影响

从表1可以看出，接种根腐病菌+木霉拌土处理与对照的根部β-1，3-葡聚糖酶活性差异极显著。其中，接种根腐病菌P3.1+木霉剂拌土、接种根腐病菌P3.5+木霉拌土两个处理的根部β-1，3-葡聚糖酶活性无显著性差异，且活性较高。说明木霉菌株P3.9能显著促使菌株P3.1和P3.5引起的枇杷根腐病株根部β-1，3-葡聚糖酶活性增加，能显著降低由菌株P3.6引起的枇杷根腐病株根部β-1，3-葡聚糖酶活性。木霉拌土处理与对照的差异不显著，说明木霉菌株P3.9不能显著影响枇杷健康植株根部β-1，3-葡聚糖酶活性。

接菌处理与对照的根部内切β-1，4-葡聚糖酶活性差异极显著。其中，接种根腐病菌P3.1+木霉拌土、接种根腐病菌P3.6+木霉拌土处理两个处理显著高于对照，接种根腐病菌P3.5+木霉拌土、木霉拌土两个处理显著低于对照。说明木霉菌株P3.9能使病原菌菌株P3.1和P3.6引起的枇杷根腐病株根部内切β-1，4-葡聚糖酶活性显著增加，能显著降低由病原菌P3.5引起的枇杷根腐病株及健康植株根部内切β-1，4-葡聚糖酶活性。

接种根腐病菌P3.1+木霉拌土、接种根腐病菌P3.6+木霉拌土处理与对照的根部外切β-1，4-葡聚糖酶活性差异极显著，其他处理间差异不显著。说明木霉菌株P3.9能使病原菌菌株P3.1和P3.6引起的枇杷根腐病株根部外切β-1，4-葡聚糖酶活性显著增加，不影响病原菌P3.5引起的枇杷根腐病株及健康植株根部外切β-1，4-葡聚糖酶活性。

2.4 对根部α-淀粉酶活性的影响

从表1可以看出，接种根腐病菌P3.1+木霉拌土、木霉拌土与对照的根部α-淀粉酶活性差异极显著，其余处理间差异不显著。说明木霉菌株P3.9能使病原菌菌株P3.1引起的枇杷根腐病株根部α-淀粉酶活性显著增加，能显著降低健康植株根部α-淀粉酶活性，不影响其余两个菌株引起的枇杷根腐病株根部α-淀粉酶活性。

表1 根腐病菌+内生木霉菌株P3.9处理对枇杷根部相关酶活性的影响

3 结论与讨论

试验结果表明，内生木霉菌株P3.9与枇杷互作，可促使枇杷根部过氧化物酶和纤维素酶活性显著增加，几丁质酶和α-淀粉酶活性显著降低，β-1，3-葡聚糖酶活性几乎未发生改变。木霉细胞壁含有几丁质，枇杷根部几丁质酶活性降低，有利于木霉定殖于枇杷根部，为有效控制枇杷根腐病提供保障。β-1，3-葡聚糖酶活性几乎未发生改变，说明木霉菌株P3.9不是病原菌。过氧化物酶参与细胞活性氧代谢，木质素和木栓质的合成，其活性的增加，能增强枇杷抗病性，说明木霉菌株P3.9能诱导枇杷根系产生抗性。α-淀粉酶与植物抗性有关，抗病品种中其活性低于感病品种，也反映出木霉菌株P3.9对枇杷根部有诱导抗性作用。据报道，疫霉属(Phytophthora)真菌能引起柑桔[11]、鳄梨[12]等果树根腐病，木薯[13]、山毛榉[14]、开心果[15]、松树[16]、樱花[17]、栎树[18]、棕榈树[19]、圣诞树[20]、山茶[21]等乔木根腐病。疫霉菌细胞壁含有大量纤维素，枇杷根部纤维素酶活性增加，有利于抵抗疫霉菌引起的根腐病。由此推测木霉菌株P3.9可能能够防治疫霉引起的其他果树或林木根腐病。

本试验中，内生木霉菌株P3.9与枇杷根腐病菌互作，促使枇杷根部过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性显著增加。与黄绿木霉T.aureoviride对水稻稻瘟病菌[22]、大豆抗腐霉根腐病菌Pythiumultimum[23]、油菜抗黑胫病菌Leptosphaeriamaculans[24]的防御机制相同。苯丙氨酸解氨酶是合成水杨酸的关键酶，此酶活性增加有利于水杨酸的积累。水杨酸可以诱导几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因表达[25]，从而使病程相关蛋白积累，增强植物防病抗病能力。枇杷根腐病菌菌株P3.1、P3.5和P3.6能诱导枇杷根部抗性相关防御酶活性增加。木霉P3.9分别与病原菌P3.1和P3.5互作，几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性变化不一致，前者比对照降低，后者增加。后者结果与西瓜幼苗根系对镰刀菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum[26]的响应一致。而木霉P3.9与病原菌P3.6互作，β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性均降低。说明病原菌菌株P3.1、P3.5和P3.6致病性存在差异，菌株P3.6致病性最强，菌株P3.5最弱，菌株P3.1居中。现已证明上述3株枇杷根腐病菌致病性差异与根腐病情指数一致(待发表)，但导致其致病性差异的原因尚未明确，有待进一步研究。内生木霉菌株P3.9分别与病原菌P3.1和P3.6互作，枇杷根部内切β-1，4葡聚糖酶和外切β-1，4葡聚糖酶活性增加。内生木霉P3.9菌株与病原菌P3.5互作，内切β-1，4葡聚糖酶活性降低，外切β-1，4葡聚糖酶活性不受影响。这2种酶是否与枇杷根腐病菌致病性有关，有待进一步研究。