采用液相色谱-质谱/质谱法（配APCI和ESI源）检测核桃中的井冈霉素

井冈霉素，也被称为有效霉素，是一种水溶性抗生素，其由吸水链霉菌井岗变种而产生，于20世纪末由上海农药研究所在江西井冈山地区土壤中采用筛选分离技术得到[1]。井冈霉素属于七碳氨基环醇类抗生素，主要通过抑制真菌和昆虫中海藻糖酶的活性来展现其出色的抗真菌活性以及抗虫活性[2]。井冈霉素已经被广泛用于水稻纹枯病立枯丝核菌的杀菌和防治[3-4]。井冈霉素除了具有良好的防治植物病虫害的作用外，还表现出良好的生物安全性，在植物、农作物以及土壤中残留较少，且残留的微量井冈霉素不会被人体肠道吸收，可直接被排出体外，这一特性有助于减少农药残留对人体健康的损害[5-7]。目前，已经有近300种井冈霉素在我国获得农药登记，鉴于其在农业方面突出的作用，井冈霉素的检测对于分析农作物上的农药残留量至关重要。

井冈霉素的传统检测方法主要有薄层色谱法[8]、毛细管电泳法[9-10]、气相色谱法[11]、液相色谱法[12]以及液相色谱-串联质谱法[13-15]等。其中，毛细管电泳法检出限为0.2 μg·mL-1，灵敏度较低；气相色谱法测定井冈霉素需要衍生，过程烦琐，实验过程耗时长，需要操作人员对实验设备及实验操作都有较高程度的掌握，实验结果容易受人员因素影响；液相色谱法检测井冈霉素时，在210 nm处有最大吸收，但多数物质在该波长下有一定程度的吸收，容易引起基质干扰，导致定性能力较差。因此，建立一种简单高效的井冈霉素检测方法对于井冈霉素以及其他农药残留分析具有重要的意义。超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）作为一种有效的检测方法，受到研究人员的广泛关注。该法可以将质谱的高选择性、高灵敏度与液相分离相结合，近年来在农药检测中被广泛应用。目前现行有效的食品安全法规定的方法为GB 23200.74—2016，标准中规定的仪器设备为液相色谱-质谱/质谱仪，配大气压化学电离源（APCI源）。但各检测单位对APCI源的使用频率较低，大部分单位都很少配置，主要使用电喷雾离子源（ESI源）。如果ESI源也能用于井冈霉素的检测，则不限制检测仪器的科学实验就可以减少成本，方便科学研究的分析检测。

本文分别使用APCI源和ESI源同时对核桃中井冈霉素进行了检测分析，以期为井冈霉素的检测分析提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃，新疆阿克苏。

井冈霉素（纯度99%，DRE）；乙腈、甲醇（色谱级，德国默克）；去离子水；HLB小柱，6 mL/200 mg，上海安谱。

1.2 仪器与设备

Q-sight 4500 PE液 相 色 谱-质 谱/质 谱 仪；QTRAP 6500三重四极杆-线性离子肼质谱系统，美国AB Sciex公司；UPLC液相色谱系统，PE公司，美国AB Sciex公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

（1）标准溶液的配制。准确称取标准品井冈霉素10 mg（精确至0.01 mg），用水溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，稀释溶解得到浓度为1 mg·mL-1的标准储备液，待用部分需冷藏避光保存。

（2）标准工作液的配制。准确吸取适当体积的上述标准储备液，用水溶液根据不同浓度需要给予稀释，分别得到浓度为2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的标准工作溶液。

（3）标准工作曲线。将上述工作液一式两份分装样品瓶，待上机检测，以井冈霉素浓度值为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

1.3.2 样品处理

实验采用相同的前处理过程。称取约2.5 g核桃样品（精确至0.01 g），置于聚四氟乙烯离心管中，加入25 mL CH3OH溶液，用均质器高速匀浆提取2 min，5 000 r·min-1离心7 min，收集上清液于另一个离心管中。离心后的残渣用5 mL CH3OH溶液重复上述提取步骤1次，合并上清液，在45 ℃水浴下氮吹浓缩至2.5 mL以下，待净化。取氮吹浓缩后的待净化溶液转移到活化过的HLB固相萃取柱中，调整流速为1滴/s，过固相萃取柱，待溶液刚要全部流出，液面马上要消失还没有消失的时候，用2 mL水淋洗柱子，将全部的流出溶液和淋洗溶液收集到适当体积的刻度试管中，加水定容至5.0 mL，混匀，过0.22 μm滤膜，分别供配备APCI源及ESI源的液相色谱-串联质谱仪进行测定。

1.3.3 仪器条件

前处理完成后，将经过相同步骤处理的样品溶液分装到不同样品瓶中，上机待测。实验使用相同填料及规格的色谱柱（色谱柱为安捷伦C18色谱柱100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温均为40 ℃，流动相A均为CH3OH，流动相B均为0.05%的CH3COONH4缓冲溶液。根据实验仪器状态的不同，参数略有差异，APCI源流速为0.8 mL·min-1，进样量为2 μL，APCI源洗脱梯度见表1。ESI源流速为0.4 mL·min-1，进样量为5 μL，ESI源洗脱梯度见表2。

表1 APCI源梯度洗脱条件表

表2 ESI梯度洗脱条件表

2 结果与分析

2.1 定性信息确认

实验通过对比标准品和待测物的仪器保留时间和离子对丰度比进行定性分析。ESI离子对谱图见图1，APCI离子对谱图见图2（图中浓度为2.0 ng·mL-1）。APCI源及ESI源的保留时间及结果偏差见表3，相对离子丰度比及结果偏差见表4。从结果可见标准品与待测物之间的保留时间与出峰状态足够相近，偏差均能够满足定性要求。

表4 APCI源及ESI源相对离子丰度比结果及偏差表

图1 ESI离子对谱图

图2 APCI离子对谱图

表3 APCI源及ESI源保留时间及偏差表

2.2 线性方程

按照1.3.1实验方法配制2～200 μg·L-1浓度范围的溶剂标准溶液，分装样品瓶分别上机检测。APCI源及ESI源均在2～200 μg·L-1性关系良好，相关系数R2均大于0.99，具体结果见表5。

表5 标准曲线结果表

2.3 方法的灵敏度、准确度和精密度

在10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、100 μg·kg-13个加标浓度下进行加标回收实验验证，3个浓度水平分别重复3次、7次、3次。如表6所示，APCI源井冈霉素在核桃中的平均回收率为81.8%～87.2%，标准偏差为2.8%～7.0%，定量限为5.79 μg·kg-1；ESI源井冈霉素在核桃中的平均回收率为81.8%～86.1%，标准偏差为5.1%～12.0%，定量限为8.66 μg·kg-1。

表6 APCI源及ESI源检出限、准确度结果表

3 结论

APCI源与ESI源均适用于核桃中井冈霉素的检测。实验在APCI源进样量更小的情况下，APCI源的定量限依然明显低于ESI源，灵敏度更高，但不完全是离子源的原因，可能还与色谱条件、仪器状态等其他因素有关。若实验对灵敏度要求较高，则选用APCI源更合适。

两种离子源的质谱仪检测下，待测物在2～200 ng·mL-1线性关系均能够满足相关，R2均大于0.99；在不同加标水平下平均回收率在60%～120%（APCI源方法检测回收率为78.4%～98.8%；ESI源方法检测回收率为80.7%～107.9%）；偏差结果均小于22%（APCI源方法检测偏差为2.0%～7.8%；ESI检测方法偏差为1.1%～12.0%），多项指标均满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的技术要求。实验过程中发现，相同的样品处理操作下，ESI源结果的稳定性尽管同样满足要求，但是相比于APCI源较差些（偏差结果也同样反映此问题，ESI源偏差值更大）；同样样品小瓶移至APCI源检测，结果重现性更好。但是并不能完全归因于离子源原因，可能还与仪器设备的厂家不同、硬件原理各有差别、质谱优化参数各不相同以及每台仪器状态也具有一定的随机性等有关，因此ESI源结果稳定性较差的原因有待进一步研究。