新会柑果汁发酵制备细菌纤维素技 术研究

吴林达，林兴奋，黄晓慧，陆凤珍，梁钰欣，杨毅红

（电子科技大学中山学院材料与食品学院，广东 中山 528400）

【研究意义】细菌纤维素（Bacterial cellulose,BC）是一类由葡萄糖单元通过β-1,-4 糖苷键连接组成的高分子聚合物［1］，具有良好的机械强度、吸水性及可生物降解性等优点［2］。传统以椰汁为原料制备细菌纤维素成本较高［3］，因此寻求质优价廉的培养原料替代椰汁具有较好的市场前景。新会柑肉作为生产新会陈皮的副产物，通常被大量废弃从而导致环境污染，探索以其作为主要原料制备BC 膜，对提高当地农副产品的经济和环境效益具有重要意义，同时可为新会废弃柑肉的资源化利用提供新思路。【前人研究进展】在新会柑肉资源化利用方面，有食品公司利用酵母菌和醋酸菌发酵柑汁，并制成新会柑酵素等食品［4］，或将新会柑果汁发酵成饮料［5］，或将柑橘渣作为原料发酵BC 膜［6］。王玮瑜［7］研究用西瓜汁和苹果汁生产出了性能良好的BC 膜，表明果汁等原料制备BC 有较好的技术可行性。木醋杆菌和红茶菌是发酵BC 常用的菌种［8-10］，红茶菌主要由酵母菌、醋酸菌和少数乳酸菌组成，可通过发酵产生葡萄糖醛酸、纤维素等成分［11-13］；而pH是影响BC 产率的重要因素之一，pH 为6.0～7.0可有效提高BC 产率［13］。关于BC 膜的应用方面，改良后的BC 膜具备抗菌、防紫外线功能等新的性能特征，可应用于生物医疗辅料促进伤口愈合或可降解包装材料等方向［2,14］。【本研究切入点】前人对BC 培养方式的研究表明，不同培养条件下BC 产率存在差异，如西瓜汁生产BC 的产率是苹果汁的1.9 倍［7］，经紫外诱变及筛选后的木醋杆菌生产BC 的产率提升了4.8 倍［8］，酶解后柑橘渣生产BC 的产率提高了2.2 倍［6］。由此可见，不同的原材料、菌种及培养方式均会对BC的产率以及性质产生明显的影响。【拟解决的关键问题】本研究以新会柑肉果汁为主要原料制备BC 膜，通过单因素分析及膜性能表征，探究新会柑果汁作为生产BC 原料的可行性，可为新会柑肉的开发利用提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种：红茶菌，购于红茶菌酵素有限公司。

种子培养基(g/L)：红茶叶10 g，蔗糖100 g，蒸馏水1 000 mL，煮沸5 min 后将茶叶捞出，于高压蒸汽灭菌锅121 ℃条件下灭菌15～20 min，灭菌后冷却置4 ℃下冷藏保存。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钠8 g，磷酸二氢钾5 g，硫酸镁2 g，柠檬酸2.0 g，以新会柑果汁补足至1 000 mL。用0.1 mol/L NaOH 调节pH 至6.8～7.0，置于高压蒸汽灭菌锅 121 ℃条件下灭菌20 min，冷却后在4 ℃下冷藏保存［15］。

主要仪器：恒温振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；BPG-9106A 精密鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；珠江牌培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；手提式折光仪，东莞三量量具有限公司；PHS-3C-02 型实验室pH 计，上海三信仪表厂；SHZ-D 循环水式真空泵，巩义市子华仪器有限公司；数显恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司；梅特勒-托利多系列电子天平，梅特勒-托利多国际有限公司；日立S-4800 扫描电子显微镜，日本Hitachi 公司；傅里叶变换红外光谱仪，日本岛津实验器材有限公司；X 射线衍射仪，德国国布鲁克公司。

1.2 试验方法

1.2.1柑肉预处理 将新会柑剥皮、去核分离出来的柑肉榨汁后，经0.425 mm 筛网分离出多余的果渣。分别在柑汁中添加0.1%（W/V）的果胶酶、纤维素酶、纤维素+果胶酶［15］，室温下搅拌均匀且酶解12 h 后，置于高压蒸汽灭菌锅121 ℃下灭菌20 min，分别得到纯柑汁、果胶酶解液、纤维素酶解液、纤维素+果胶酶解液（即培养原液），于4 ℃下冷藏保存备用。

1.2.2菌种活化与静态培养 接入10 mL 红茶菌菌液至种子培养基，并置于恒温振荡器中，28 ℃、120 r/min 条件下培养48 h 完成活化，将菌种保存于4 ℃的冰箱中备用。按培养基 10% (V/V) 的接种量接入活化菌种后，使用封口膜封口处理，置于恒温培养箱中28 ℃下静置培养11 d［7］。

1.2.3单因素试验 在1.1发酵培养基的基础上，分别改变柠檬酸添加量、发酵时间、pH 及培养原液，探究其对BC 膜产率的影响［8,15］：（1）pH分别设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他营养成分不变；（2）柠檬酸添加量分别设置为0、2、4、6、8 g/L，其他营养成分不变，调整pH 为 6.8～7.0；（3）发酵时间分别设置为9、11、13、15、17 d，培养原液营养成分不变，调整pH 为6.8～7.0；（4）培养原液分别设置为纯柑汁、纤维素酶解液、果胶酶解液、纤维素+果胶酶解液，其他营养成分不变，调整pH 为6.8～7.0。单因素试验的培养条件依照1.2.2 的静态培养法，培养出的细菌纤维素膜按照1.2.4 的步骤进行纯化，按1.3.2 的干膜产率计算方法评价细菌纤维素产率，确定红茶菌最佳发酵条件。

1.2.4纤维素膜的纯化 将静态培养的BC 膜用流水冲洗10 min 后，置于0.1 mol/L NaOH 溶液中煮沸 30 min，至呈现白色半透明状态，然后用蒸馏水冲洗至湿膜表面pH 为 7.0 左右［7］。

1.3 测定项目及方法

1.3.1糖度、pH 测定及BC 膜评价 分别用手提式折光仪和pH 计测定柑汁及酶解液的糖度和pH值。采用干膜产率、含水率和复水率评价BC 膜。用滤纸拭去膜表面水分并称重，得到湿膜质量；再将其置于烘箱中50 ℃下干燥12 h，称量，得到干膜质量［7］。称量BC 膜的湿膜、干膜质量后，计算BC 产率及含水率［16］。干膜称重后，于培养皿中用蒸馏水浸泡24 h，用滤纸拭去其表面水分，称重，计算BC 膜的复水率。

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1.3.2红外光谱（FTIR）和扫描电镜（SEM）观察 测试前将4 种培养原液生产出的BC 膜分别置于50 ℃烘箱内烘干30 min，冷却至室温后加入适量KBr 粉末研磨，混合均匀后压片，以分辨率4、扫描范围400～4 000 cm-1条件下进行红外光谱扫描，并进行数据库检索比对［17］。

分别剪取边长为1～1.2 cm 的四方形BC 膜贴于导电胶上，置于真空镀膜机内进行表面喷金1 min，于扫描电镜中，在观察电压为5 kV 条件下进行观察［10,17］。

1.3.3X 射线衍射（XRD）BC 膜于50 ℃烘干后，冷却并研磨至粉末状，取适量粉末置于X 射线衍射仪，在 40 kV 高压、Cu 靶、管流设置为 40 mA、衍射角度2θ 为5°～50°检测条件下进行XRD扫描，并用jade 软件检索标准物质［17-18］，计算结晶度（CI）：

式中，Iam为非结晶区衍射角度2θ 为18°时的强度值，I020为衍射最高强度值。

2 结果与分析

2.1 柑汁不同预处理前后基本特征的变化

未经酶解处理的新榨柑汁含有较多果胶和纤维，柑汁经3 次过滤后仍浑浊粘稠；而经酶解预处理后的柑汁澄清，底部出现黄色絮状沉淀。由图1 可知，纯柑汁、果胶酶解液、纤维素酶解液、纤维素+果胶酶解液的糖度分别为10.9%、7.1%、6.9%、8.2%，酶解后的糖度均低于未酶解处理的糖度，其原因可能是未经灭菌处理的柑汁本身存在有酵母菌等嗜糖性的微生物，酶解时间过长导致微生物生长消耗一部分糖分使得糖度降低；酶解液的pH 与纯柑汁没有明显差异，均为偏酸性。

图1 不同培养原液的pH 及糖度对比Fig.1 Comparison of pH and Brix of different culture solution

2.2 BC 产率的单因素分析

由图2A 可知，柑汁未添加柠檬酸时BC 产率最大，在柠檬酸添加量达到4 g/L 时无BC 产生。在发酵培养基配方设计中添加柠檬酸的原因是柠檬酸参与红茶菌的三羧酸循环，进行物质转换和能量代谢，可有效提升红茶菌的新陈代谢能水平，从而提高BC 产率［15,19］；但柠檬酸过高，三羧酸循环的反馈机制增强，可能导致产率下降，由于新会柑含有大量以柠檬酸为主的有机酸，对于柑汁培养基而言，额外添加柠檬酸对BC 膜产率起抑制作用。为避免添加柠檬酸导致pH 再变化，本研究在添加柠檬酸之后统一调整pH 至6.8～7.0，以消除柠檬酸对pH 的影响。

由图2B 可知，pH 对BC 膜的产率具有明显影响，当pH 为6.0 时BC 膜产率最高，pH 在5.0～7.0之间的变化相对较小，偏离此范围后产率快速下降。红茶菌适合在弱酸性的培养环境中生长，发酵液最佳的初始pH 在6.0 附近［13］。对柑汁预先进行酶解处理，在产率上没有明显优势，反而略低于纯柑汁作为培养原液的产率。

由图2C 可知，在一定时间范围内BC 产率与培养时间呈正相关，在15 d 到达峰值后呈下降趋势。原因可能是红茶菌生产的BC 膜也是其代谢所需要的碳源，当培养液中的碳源耗尽时，红茶菌对BC 膜消耗速率高于分泌速率［20］。由图2D可知，酶解预处理对产率无明显促进作用，不同预处理培养原液的BC 产率依次为纯柑汁＞果胶酶+纤维素酶解液＞纤维素酶解液＞果胶酶解液。

图2 不同因素对BC 产率的影响Fig.2 Effects of different factors on BC yield

2.3 BC 膜的结构表征

2.3.1含水率及复水率 如图3 所示，不同培养原液生产的BC 膜均呈黄褐色半色透明的水凝胶状，经纯化后呈白色透明凝胶状，烘干后干膜呈纸片状。由图4 可知，4 种培养原液制备的BC 膜含水率均在98%以上，复水率均高于75%，具有重要基团频率分析对比，在1 127 cm-1附近出现的吸收峰代表C-O 键的伸缩振动，2 875 cm-1附近的吸收峰代表C-H 键的伸缩振动，3 350 cm-1附近区域的吸收峰则反映O-H 基的伸缩振动，表明BC 膜主要存在O-H 基、C-H 键和C-O 键［17］。样品图谱经本地数据库进行检索对比，结果表明该物质为纤维素。良好的持水性能和复水性能，有利于活性物质吸附的变性处理［21-22］。

图3 BC 膜处理前后的直观变化Fig.3 Intuitive change diagram of BC membrane before and after treatments

图4 不同培养原液的BC 膜含水率及复水率对比Fig.4 Comparison of water content and rehydration rate of BC membrane with different culture solutions

2.3.2红外光谱表征分析 由图5 可知，不同培养原液的红外光谱均存在3 处明显的吸收峰，经

图5 细菌纤维素的红外光谱Fig.5 Infrared spectrum of bacterial cellulose

2.3.3X 射线衍射分析 以强度为纵轴、衍射角为横轴，将不同培养原液培产出的BC 膜进行XRD 扫描，由X 射线衍射谱图（图6）可知，3个衍射角度14.1°、16.5°、22.9°分别代表纤维素结构的（01）、（11）和（002）3 个晶面的衍射峰［17-18］，经Jade 软件检索分析得出该样品为纤维素，化学式为（C6H10O5）n；不同培养原液产出的BC 膜的结晶度均在80%以上。BC 膜的结晶度越高，其纤维的伸拉强度、密度也会相应增大，同时因结构致密，外部的水分子不易进入纤维内部，吸水性、柔软性及化学活性会相应降低。

图6 细菌纤维素的XRD 谱图和结晶度对比Fig.6 XRD pattern and crystallinity comparison of bacterial cellulose

2.3.4BC 膜的微观结构 由图7 可知，4 种不同培养原液产出的BC 膜均有三维网状结构，但其纤维的结晶形态表现出较大的差异，其中纯柑汁产出的BC 膜纤维较为纤细、具有多孔隙特征（图7A），果胶酶解液产出的BC 膜纤维呈棱柱状（图7B），而纤维素酶解液、纤维素+果胶酶解液产出的BC 膜则分别呈现出球形和方形结构（图7C、D）；所有BC 膜的纤维直径均在80～400 nm之间，与王珊珊等［19］试验所得的BC 膜相比，纤维直径基本一致，但本研究中BC膜表面存在球形、方形纤维团和棱柱状纤维束的形态，不同微观结构的生成机制仍有待探究。

图7 不同培养原液产出的BC 膜的SEM 图Fig.7 SEM images of BC membranes produced by different culture solutions

3 讨论

新会柑果汁中除含糖分和有机酸外还存在纤维和果胶类物质［23］，本研究结果表明，经果胶酶和纤维素酶酶解处理后的柑汁糖度下降而pH基本不变。研究表明，用纤维素和果胶酶处理柑橘果渣后，BC 产率有明显提高［15］，而本研究酶解处理新会柑果汁后，BC 产率反而下降。结合相关研究［15,17］分析，其产率下降的原因可能是酶解时间过长导致糖分消耗下降，嗜糖的红茶菌因后期可利用的糖分减少而导致BC 膜产率下降。红茶菌为复合菌种，多次传代后BC 的产率不稳定。因此从红茶菌中筛选出适应酸性果汁环境的高产菌种，并建立相应的发酵模型是未来新会柑果汁生产BC 的探索途径之一［10］。

单因素试验结果显示，以纯柑汁为原料，在不添加柠檬酸且发酵时间为15 d、pH 为6.0 的条件下可有效提高BC 膜的产率。与前人生产条件［13,15,19］相比，本研究不同点是无需添加柠檬酸且发酵时间偏长。推测原因可能是过多的柠檬酸导致红茶菌三羧酸循环的负反馈机制增强［19］，从而使得产率下降；不同的培养原料和菌种会导致达到BC 最大产率所需的时间不同。以新会柑果汁为原料生产BC 需添加碱性物质调节培养液的pH，但其成本将提高，因此寻求廉价的碱性调节剂或适应酸环境的优势菌种是新的研究方向。

不同碳源产出的BC 膜可能具有不同的微观结构，从而影响BC 膜的物理性能［22］。有研究表明，以秸秆水解液生产的BC 膜在SEM 图下呈现超细纤维的三维网状结构［24］。本研究以不同培养原液产出的BC 膜在SEM 图则呈现出不同的纤维排列形态和结晶状态，具体表现在SEM 图出现了类似方形、球形、棱柱状的纤维素，但其作用机制尚未明确。结合复水性能、红外光谱和X 射线衍射得出，各培养原液培养出的产物均为结晶度在80%以上的BC 膜，不仅复水能力强且具有良好的张拉力学性能，与前人研究基本一致［17］。

4 结论

新会柑果汁的糖度为10.9%、pH 为3.9，酶解前后pH 保持一致但糖度均有所下降。单因素试验表明，以纯柑汁为原料，在不添加柠檬酸且发酵时间15 d、pH 为6.0 的条件下得到的BC 产率相对最高。采用纯柑汁、果胶酶解液、纤维素酶解液、纤维素酶+果胶酶解液生产BC 膜，通过复水性能测试、X 射线衍射和SEM 分析得出，4 种类型BC 膜的复水率均高于75%、结晶度均高于80%，但其微观结构存在较大差异，主要表现为BC 表面纤维的形态和结晶状态的不同。本研究结果可为新会柑果汁生产BC提供技术支持，既能降低BC 的生产成本，同时也为新会柑的资源化开发提供思路。