响应面法优选川芎醇提工艺*

刘雨晴，景炳年，谢晓阳，魏 磊，李 建，张华南，王 韬，朱 杰，刘冠华，陈 飞

（1.河南省科学院，河南 郑州 450002；2.河南省纳普生物技术有限公司，河南 郑州 450002）

川芎Ligusticum chuanxiongHort.是多年生、伞形科藁本属植物，广泛分布于四川、广西、贵州、湖北及云南等地［1］，药用部位为干燥的根茎。《外台秘要方》收录美容方剂363首，包括外用方和内服方，其中川芎是唯一入药频次均为前5的中药［2］。川芎粗提物可抑制酪氨酸酶活性，从而起到抑制黑色素生成的作用［3-7］。本研究中以阿魏酸得率为考核指标，在单因素试验基础上，采用响应面法综合分析乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间4个最佳工艺参数［8-12］，优选川芎醇提取工艺，以期为川芎植物资源在化妆品方面的充分、合理开发提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

KQ-500E型超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；UV-3802型紫外可见分光光度计（尤尼柯<上海>仪器有限公司）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110773-201915，含量≥98%）；试验所用试剂均为分析纯。川芎药材购自河南郑州中药批发市场，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸含量测定

2.1.1 溶液制备

取阿魏酸对照品2.33 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入甲醇超声（功率500 W，频率40 kHz，下同）处理20 min，滤过，取续滤液，即得对照品溶液。取药材样品粗粉适量，精密称定，置500 mL锥形瓶中，加入提取溶剂超声处理20 min，重复3次，合并3次滤液，抽真空旋转浓缩，以甲醇定容至50 mL，即得供试品溶液。

2.1.2 最大吸收波长确定

取阿魏酸对照品溶液，置1 mL比色管中，进行200～400 nm波长全扫描，获得吸收光谱图，确定其最大吸收波长为320 nm，故以此为检测波长。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察［13］：取阿魏酸对照品溶液0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分别置25 mL容量瓶中，依次加入甲醇6 mL、0.3%十二烷基硫酸钠2 mL、0.9%铁氰化钾-0.6%三氯化铁（1∶1，V/V）混合液1 mL（现配现用），充分摇匀，暗处放置5 min，加入1 mol/L冰醋酸溶液定容至25 mL，摇匀，暗处放置30 min，测定320 nm波长处的吸光度。以阿魏酸质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得阿魏酸回归方程为Y=199.27X+6.70（R2=0.994 6，n=6）。结果表明，阿魏酸质量浓度在2.83～6.60 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

其他：按相关要求进行方法学考察，结果精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度、溶液稳定性、方法重复性均良好。

2.2 单因素试验

乙醇体积分数：分别以体积分数为35%，50%，65%，80%，95%的乙醇，料液比为1∶20（g/mL），160℃下超声提取60 min。结果阿魏酸得率随乙醇体积分数的增大呈先升后降的趋势，乙醇体积分数为80%时得率最高，故选择80%乙醇进行后续试验。详见图1 A。

图1 单因素试验考察结果A.Volume fraction of ethanol B.Solid-liquid ratio C.Ultrasonic temperature D.Ultrasonic timeFig.1 Results of the single factor test

料液比：分别以料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），80%乙醇，160℃下超声提取60 min。结果阿魏酸得率随料液比的增大呈先升后降的趋势，当液料比为1∶20（g/mL）时得率最高，故选择料液比1∶20（g/mL）进行后续试验。详见图1 B。

超声温度：以80%乙醇，料液比1∶25（g/mL），分别在30，40，50，60，70℃下超声提取60 min。结果阿魏酸得率随超声温度的升高呈先升后降的趋势，当温度为60℃时得率最高，故选择超声温度60℃进行后续试验。详见图1 C。

超声时间：以80%乙醇，料液比1∶25（g/mL），在60℃下分别超声提取20，40，60，80，100 min。结果阿魏酸得率随超声时间的延长呈先升后降的趋势，当超声80 min时得率最高，故选择超声80 min进行后续试验。详见图1 D。

2.3 响应面法

试验设计与结果：根据单因素试验结果，以乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声温度（C）和超声时间（D）为自变量，阿魏酸得率为响应值，采用4因素3水平的Box-Behnken试验，因素与水平见表1，响应面试验设计和试验结果见表2。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and their levels

表2 Box-Behnken试验设计方案Tab.2 Design of the Box-Behnken test

模型的建立及其显著性检验：采用Design-Expert 12数据统计分析软件对试验设计和试验结果进行多元回归、拟合，得二次多项回归模型为，Y=0.098 2+0.0081A+0.0046B+0.0030C+0.0056D+0.0043AB+0.000 0AC+0.002 6AD+0.002 2BC+0.003 3BD-0.001 7CD-0.015 7A²-0.018 4B²-0.003 9C²-0.002 2D²。

结果分析：由表3可见，对结果的影响，一次项A，B，D极显著（P<0.01），C显著（P<0.05）；二次项A2，B2极显著（P<0.01），C2，D2不显著（P>0.05）。试验因素系数F=16.80（P<0.000 1），说明该模型拟合程度良好，回归极显著，总决定系数R2=0.943 8，校正决定系数R2Adj=0.887 6。结果表明，回归模型可很好地描述川芎醇提工艺各因素与阿魏酸得率之间的关系。

表3 方差分析结果Tab.3 Results of the ANOVA

响应面交互作用：为确定上述4因素及其交互作用对川芎阿魏酸得率的影响，根据回归方程绘制响应面图。4个因素之间双因素交互作用的响应面均为开口向下的凸形曲线，表明试验范围内阿魏酸得率的响应值存在极高值，即醇提最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。详见图2。

图2 各因素对川芎阿魏酸得率影响的响应面图A.Solid-liquid ratio and volume fraction of ethanol B.Ultrasonic temperature and volume fraction of ethanol C.Ultrasonic time and volume fraction of ethanol D.Ultrasonic temperature and solid-liquid ratio E.Ultrasonic time and solid-liquid ratio F.Ultrasonic time and ultrasonic temperatureFig.2 RSM plots of the influence of various factors on the yield of ferulic acid from Ligusticum chuanxiong

2.4 验证试验

川芎最佳醇提工艺条件为乙醇体积分数为80.68%，料液比为1∶21.77（g/mL），超声温度62.68℃，超声时间60 min。在此条件下，川芎阿魏酸得率的理论预测值为0.098%。为进一步确认本研究响应面结果的可靠性，并充分考虑实际可操作性，将最佳提取工艺参数修正为，80%乙醇、料液比1∶21（g/mL），在63℃下超声提取60 min。川芎阿魏酸的实际平均得率为（0.096±0.02）%（n=3），与理论预测值0.098%相对误差较小。

3 讨论

阿魏酸是川芎药材的重要活性成分之一。本研究中最佳醇提工艺经3次平行试验验证，阿魏酸实际得率与模型理论预测结果相对误差较小，优化工艺参数稳定可靠。阿魏酸可溶于乙醇及乙酸乙酯，脂溶性较小，本研究中80%乙醇为超声提取的最佳溶剂，与阿魏酸的上述特性相互印证。

川芎最佳醇提取工艺条件为，以80%乙醇、料液比为1∶21（g/mL），在63℃下超声提取60 min。实际测得的阿魏酸平均得率为（0.096±0.02）%，与理论预测值（0.098%）相对误差较小。

综上所述，优化后的川芎醇提工艺稳定可行，可为川芎开发应用提供依据。