银耳多糖的抗光老化作用初探

于玲

（福建省轻工业研究所有限公司，福建 福州 350005）

皮肤是人体最大的器官，有着保护、调节、感觉等功能，但其长期暴露在具有各种危险因素，如紫外线（UV）、化学物等[1,2]的环境中。UV的照射可导致皮肤产生一系列毒性效应，包括红斑、水肿、脱屑、皮肤炎症、光老化以及光致癌[3-5]，这与活性氧簇（ROS）、氧化应激及DNA、脂质、蛋白等氧化损伤相关。UVB（波长280～320 nm）可造成细胞DNA损伤，生成嘧啶二聚体损伤表皮细胞，是人类皮肤癌的主要致癌物[6,7]，因此，为减缓皮肤光老化寻找合适的抗光老化产品日益受到重视。

近期，多种自然化合物正作为抗氧化剂备受关注。银耳是一种药食兼用真菌，含有丰富的多糖、维生素、蛋白质和矿物质等营养物质[8,9]。银耳多糖（Tremella fuciformis polysaccharides，TFPS）是银耳中最主要的功效活性成分，具有补水保湿、抗氧化、美容丽肤等功效[8]，银耳多糖（TFPS）在调节UVB诱导的皮肤表皮损伤的作用仍有待研究。本文探索了银耳多糖（TFPS）对UVB照射后人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）的抗光老化作用，旨在为银耳多糖（TFPS）在具有抗光老化活性的功能护肤品或修复皮肤光损伤治疗药物方面的应用提供经验和数据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂：银耳多糖（福建省轻工业研究所中间试验工厂）；HaCaT细胞（广州艾迪基因科技有限责任公司）；CCK-8试剂盒、0.4%台盼蓝染液（碧云天生物）。

仪器与设备：紫外交联仪（UV07-II，南京宁凯仪器有限公司）；倒置显微镜（CKX53，Olympus公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养以及UV照射

采用完全培养基（含10%体积分数的胎牛血清以及终浓度为1 μmol/L 青霉素、链霉素DMEM培养基），将处于生长指数期的HaCaT细胞接种在不同规格的培养皿中贴壁培养，培养箱温度37 ℃，二氧化碳浓度5%。

用缓冲溶液PBS（浓度 0.01 mol/L，pH值为7.4）清洗培养细胞。UVB（280～320 nm）辐照强度控制为0.60 mW/cm2、照射距离20 cm，辐照计测定距离为UVB灯管20 cm处，根据公式⑴确定辐照时间。

1.2.2 细胞活力测定

不同浓度TFPS对HaCaT细胞活力的影响：将细胞接种在96孔板中（1×104细胞/孔），每组设置3个重复孔，在 37 ℃、5%二氧化碳浓度的条件下培养12 h，待细胞贴壁后，使用含相应终浓度为0、1、2、3、4、5 mg/mL的TFPS的完全培养基培养48 h后，根据 CCK-8试剂盒的说明书，向每孔加入110μL CCK工作溶液（100μL PBS+10μL CCK溶液），静置培养箱内，孵育45 min，使用酶标仪测定在波长450 nm处的吸光度，根据公式⑵计算细胞活力。

不同浓度银耳多糖（TFPS）对 UVB照射后HaCaT细胞活力的影响：细胞分为0、5、10、20、30 mJ组，将细胞接种在96孔板中（1×104细胞/孔），在37 ℃、5%二氧化碳浓度的条件下培养48 h，移除培养基后每孔加入100μL的PBS，用相应剂量UVB照射，然后使用含终浓度5 mg/mL的TFPS的完全培养基培养24 h，同法进行CCK-8检测，计算细胞活力。根据实验结果选择特定UVB剂量，照射同法培养的HaCaT细胞，使用终浓度分别为0、1、2、3、4、5 mg/mL的TFPS的完全培养基培养24 h，同法计算细胞活力。

将细胞接种在六孔板中（3×105细胞/孔），在37 ℃、5%二氧化碳浓度的条件下培养48 h，移除培养基，用PBS清洗3遍，每孔加入200μl的PBS后接受UVB照射。使用含相应终浓度TFPS（0、1、2、3、4、5 mg/mL）的完全培养基培养24 h，去除培养基，用PBS清洗3遍，加入0.04%台盼蓝工作液（PBS∶0.4%台盼蓝=9∶1），每孔300μL，于倒置显微镜下观察细胞着色情况，计数并进行数据分析。

1.2.3 统计分析使用Image J、PowerPoint、Graphpad Prism 5.0、Photoshop和Excel软件进行数据处理、分析以及制图。所有实验结果以平均值±标准差表示，显著性差异使用单因素方差分析（one-way ANOVA 和ttest分析），P<0.05认为具有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度TFPS对HaCaT细胞活力的影响

CCK-8 实验结果表明，不同浓度TFPS对HaCaT细胞均无毒害作用，且可促进细胞增殖（P<0.05）（图1），因此，选择5 mg/mL浓度进行后续实验。

图1 不同浓度TFPS对HaCaT细胞活力的影响

2.2 TFPS 对HaCaT细胞受不同剂量UVB照射后的细胞活力影响

HaCaT 细胞在接受5、10、20、30 mJ/cm2的UVB照射后，细胞活力均明显下降，细胞固缩，实验组细胞经5 mg/mL的TFPS处理后，除30 mJ/cm2剂量照射组外，细胞活力较对照组均明显增加（P<0.05）（图2）；台盼蓝染色结果显示实验组阳性细胞数较空白组明显减少（p<0.001），固缩细胞减少（图3），故选择20 mJ/cm2进行后续实验。

图2 5 mg/mLTFPS对不同剂量UVB照射后HaCaT细胞活力的影响

图3 台盼蓝染色结果

2.3 不同浓度TFPS（0、1、2、3、4、5 mg/mL）对UVB照射HaCaT细胞活力的影响

HaCaT 细胞在接受20 mJ/cm2UVB照射后，细胞活力均明显下降，实验组细胞经1、2、3、4、5 mg/mL浓度的TFPS处理后，细胞活力较空白组均明显增加（P<0.05），且台盼蓝染色结果显示实验组阳性细胞数较空白组明显减少（p<0.001）。

本研究的多组实验结果表明银耳多糖安全无毒，可促进HaCaT细胞增殖，有效提高UVB照射后HaCaT细胞活力。

图4 不同浓度TFPS对UVB照射后HaCaT细胞活力的影响

3 结论

研究显示银耳多糖（TFPS）预处理可以降低细胞内ROS含量，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化物质活性显著增加，还可以通过上调Nrf2和下调 Keap1表达保护人真皮成纤维细胞[10]。TFPS可通过抑制蛋白激酶B、p38丝裂原活化蛋白激酶、核转录因子-κB（NF-κB）的激活来降低脂多糖处理的RAW264.7细胞内ROS水平，还可以显著抑制促炎细胞因子的表达[11,12]。

本研究结果显示，1～5 mg/mL的银耳多糖（TFPS）安全性好，可提高HaCaT细胞被UVB照射后降低的细胞活力，研究结果表明银耳多糖（TFPS）能够促进起到抗光损伤的作用，推测可能与抗氧化作用相关，具体仍有待后续研究。本研究结果为TFPS在具有抗光老化活性的功能护肤品或修复皮肤光损伤治疗药物方面的应用提供了实验依据。