牡丹江2株香蘑属菌株的鉴定及驯化研究*

盛春鸽，王延锋，史 磊，潘春磊，王金贺，刘姿彤，张 鹏，于海洋，赵 静

（黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157000）

香蘑属（Lepista）又称晶蘑属，在分类学上隶属于担子菌亚门（Basidiomycomycotina）层菌纲（Agaricomycetes）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）。中国境内香蘑属菌株野生资源分布分散、数量稀少，常见的香蘑属菌类有花脸香蘑（Lepista sordida）、紫丁香蘑（Lepista nuda）、淡色香蘑（Lepista irina）、黄白香蘑（Lepista flaccida）、白香蘑（Lepista caespitosa）、粉紫香蘑（Lepista personata）6种。主要分布于东北、西北、内蒙古、华中等地区[1-2]。

香蘑属食用菌子实体的主要特征是：担子果口蘑状至杯伞状，丛生；常具有紫罗兰色或丁香紫色色素，失水后颜色渐淡至黄褐色；边缘内卷，具不明显的条纹，成熟时边缘常呈波状或瓣状，菌盖吸水或不吸水；菌褶直生，有时稍弯生或稍延生，中等密，淡紫色；菌柄长度为4.0 cm～6.5 cm，中生，基部多弯曲，纤维质，肉质；菌幕缺，初夏至夏季群生或近丛生于草地、农田附近、村庄路旁[3-4]。香蘑属菌类营养丰富，味道鲜美，深受广大食用菌爱好者和研究人员的青睐。子实体富含硒、锗、铁、锌、钙等微量元素和蛋白质、氨基酸等营养物质[5-6]。

以牡丹江周边为采集地点，在蘑菇爆发季节寻访黑龙江省境内牡丹峰、镜泊湖、三道关等自然保护区，对样地内的香蘑属菌株进行采集。在野外初步描述子实体菌盖颜色、菌柄及菌褶形态，用相机记录其生境。采集后带回实验室内进行组织分离，获得纯培养物后低温保存待用。结合ITS测序方法确证菌株的分类学地位，并对其进行驯化研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

菌株ZD1，2018年采自牡丹江畔环龙湾小区附近；菌株ZD8，2019年采自牡丹江市温春镇周边。具体生境条件及子实体形态见图1。

图1 野生香蘑属菌株子实体Fig.1 Fruit bodies of wild Lepista spp.strains

1.1.2 供试培养基

马铃薯综合培养基（PDA培养基）：去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g、硫酸镁0.5 g、琼脂15 g，加蒸馏水定容至1 000 mL。

1.1.3 其他主要试剂

DP305-03植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定

发现野生香蘑属菌株时，首先对其子实体进行拍照，以便最大程度的记录其生境特征。之后肉眼观察子实体颜色、菌盖大小、菌褶颜色、着生方式、菌肉薄厚程度及菌柄形态等一系列宏观特性。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增和测序

使用植物基因组DNA提取试剂盒提取菌丝DNA。采用真菌通用引物对ITS1/ITS4进行ITS序列扩增。

扩增反应体系：dNTPs（2.5 mmol·L-1）2μL、引物（0.2 mmol·L-1）各1μL、10×ExTaqPCR buffer 2μL、ExTaq（5 U·μL-1）0.1μL（TaKaRa）、DNA模板2μL，ddH2O补至20μL。

反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性50 s，57℃～58℃复性50 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃补齐7 min；4℃保存。

将扩增好的DNA片段送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将已测得的ITS序列在NCBI中通过BLAST检索比较，利用MEGA 4.0软件构建系统发育树。

1.2.3 驯化

1）母种培养基

参照1.1.2配制PDA培养基。

2）不同温度对菌丝的影响

将活化后的花脸香蘑和紫丁香蘑菌丝体分别用5 mm打孔器接种至装有20 mL PDA培养基的平板（直径9 cm）中间，每个处理4个重复。接种完后分别放在16℃、20℃、24℃、28℃、32℃的恒温培养箱中培养。当菌丝长到平板的2/3处时，测量菌落直径，比较不同温度下不同菌株菌丝的生长速度。

3）原种培养基

麦粒培养基：各成分质量比例为麦粒99%、石膏1%，含水量65%，pH自然。具体制作方法为：选用颗粒饱满、无虫蛀、无霉变的新麦粒，清水浸泡24 h后，煮至无白芯且不开花，捞出沥干水分；拌入1%石膏，装袋，126℃灭菌90 min。按常规方法接种、培养。待接种块周围菌丝长满料面时，将料面处麦粒揉散，轻轻摇匀，促进菌丝的迅速生长。一般约25天长满菌袋。

4）发酵料配方及制备

发酵料配方：各成分质量比例为玉米秸秆73%、牛粪25%、石膏1%、石灰1%。发酵料制备时应选择新鲜、干燥、无霉变、无虫蛀的玉米秸秆，使用前置于阳光充足的开阔地暴晒2 d～3 d，后用粉碎机粉碎成3 cm～5 cm的颗粒，按照配方比例备料，建堆前1天预湿，农作物秸秆等随浸随堆，风干的禽畜粪便用清水浸湿，以能捏成团、散得开为宜。培养料的含水量以65%～70%为宜。用机械或人工将培养料建成高为1.2 m～1.5 m，宽为2.5 m～3.0 m，长度不限的梯形料堆，在料堆上垂直打出行距为80 cm、孔距为50 cm的两行通气孔。记录料温变化，当温度达到55℃以上后保持温度24 h以上，至白色放线菌出现，开始翻堆，补充水分。发酵期间一般需翻堆4次，第一次翻堆后分别间隔6 d、5 d、4 d，再翻堆一次，每次翻堆应注意翻均匀，上下、里外翻透。堆制全过程大约需20 d～25 d。发酵成熟的标准为：手抓料质松软，富有弹性，料中充满白色的发热菌体，无结块，无氨味和粪臭味，具体参照参考文献[7]。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

采用形态学和分子生物学结合的方法鉴定菌株。

菌株ZD1子实体呈淡紫色；菌盖直径为7 cm，平展，边缘呈现波浪状或花瓣状，中间颜色稍浅；菌柄中生，细，长度为4 cm，直径为0.5 cm，实心；菌褶稍延生。菌株ZD8子实体呈紫罗兰色；菌盖边缘圆整，直径为6 cm，中间稍凸；菌褶直生；菌柄中生，实心，长度为6 cm，直径为0.5 cm。

经ITS测序以后，得到600 bp左右的2个片段。把这2个片段提交至GenBank，获得菌株ZD1的登录号为MZ298492，菌株ZD8的登录号为MZ298498。同时在Genbank里进行BLAST比对，结果显示菌株ZD1与Lepista sordida（KF874612.1）的同源性达到100%，菌株ZD8与Lepista nuda（MT644922.1）的同源性达99%。以松口蘑(Tricholoma matsutake）为外群，用MEGA 4.0软件构建系统发育树，结果见图2。

图2 基于ITS序列的系统发育分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on ITS sequences

由图2可知，菌株ZD1和花脸香蘑（登录号为KF874612.1和KP293583.1）聚为一个进化枝。菌株ZD8和紫丁香蘑（登录号为MT644922.1）聚为一个进化枝。

结合系统发育树和比对结果，以及子实体表型特征，可以判断菌株ZD1是花脸香蘑，菌株ZD8是紫丁香蘑。

2.2 菌株驯化

2.2.1 不同温度对香蘑属菌株菌丝生长的影响

测定在不同温度下不同菌株的菌落生长速度，结果见图3。

如图3所示，2个菌株生长情况不同，花脸香蘑菌株ZD1菌丝生长速度较快，紫丁香蘑菌株ZD8生长速度较慢。花脸香蘑在24℃时菌丝生长速度最快，平均为1.12 cm·d-1。紫丁香蘑菌株生长曲线与花脸香蘑略有不同，在20℃时菌丝生长速度最快，平均为0.55 cm·d-1。

图3 温度对香蘑属菌株菌丝生长的影响Fig.3 Effect of temperature on mycelial growth of Lepista spp.

2.2.2 花脸香蘑驯化试验

于6月初，气温为22℃～25℃，空气湿度为80%左右时，采用发酵料散播的方式进行播种。播种量以0.8 kg·m-2～1.0 kg·m-2为宜，铺料厚度约为20 cm，折合干料约为10 kg·m-2～15 kg·m-2。播种后3周左右，菌丝大部分长满料面，可对菌床进行覆土，土质以松软、透气为宜，覆土厚度为1 cm～2 cm。覆土后，控制湿度约为80%，温度为22℃～26℃，菇棚内保持适当散射光。覆土后约15 d，花脸香蘑菌丝长满土层，此时喷水至土层湿润，调节空气湿度至80%～90%，增加昼夜温差促进子实体形成。一般经过4 d～5 d，表面菌丝开始扭结，形成紫色的原基，现蕾以后，喷水方式调整为少量多次，始终保持土层湿润，且保持充足的氧气供应。原基生长5 d～7 d，子实体达到成熟，即可采收，见图4。

图4 玉米秸秆基质上的花脸香蘑子实体Fig.4 Fruit body of Lepista sordida grown on corn stalk fermentation substrate

如图4所示，花脸香蘑子实体最初呈半球形，随着成熟期的来临，菌盖慢慢平展，当子实体过度成熟时菌盖边缘会呈现波状，一般在菌盖平展、出现波浪状之前采收最为适宜。

3 结论与讨论

花脸香蘑是小众珍稀食用菌之一，近几年来，相关的研究报道越来越多。尽管如此，花脸香蘑还未被大众所熟知和接受，其研究仍然处于起步阶段，目前使用的菌种仍然以野生资源为主，尚未有商业化栽培的相关报道，市场占有率极小。

通过传统表型鉴定和ITS测序相结合的方法鉴定香蘑属菌株，结果较为可靠。刘悦萍等[8]利用ITS序列鉴定了从北京市怀柔区原始次生林区分离到的野生香蘑，确定其为花脸香蘑。张京良等[9]利用ITS序列对采集自青岛崂山的一株真菌LS7进行鉴定，证明此真菌为花脸香蘑。姜雪等[10]采用表型和分子结合的方法，准确的鉴定出了2株香蘑属菌株。刘红霞等[11]对17种野生蕈菌进行ITS鉴定，结果准确可信；并对其中8个菌株进行了驯化栽培。邹莉[12]、贾定洪[13]、岳万松[14]、王红艳[15]等分别对野生花脸香蘑菌株进行ITS序列鉴定，取得可靠的结果。

花脸香蘑驯化的相关研究国内外均有报道，国内的研究比较早而且深入；国外的研究以花脸香蘑发酵液有效成分的提取以及药理特性为主，对栽培方面的研究不多[16-18]。因此，通过结合传统分类学方法和ITS数据分析，取得可靠鉴定结果。所鉴定的2个菌株中，1株是较难驯化成功的紫丁香蘑，另外1株是比较容易驯化的花脸香蘑。目前花脸香蘑已成功驯化，紫丁香蘑的驯化及出菇条件还有待于进一步研究。

花脸香蘑属于草腐菌，可以利用农作物秸秆进行栽培。但目前其栽培管理方式较为粗放，缺乏一套成熟、系统的栽培模式和管控措施。菌种资源也较为有限，多为研究者采集后通过组织分离获得，品种选育和改良能力较弱。花脸香蘑产业链还有待建立、健全，种质资源、栽培、育种、病虫害防控以及精深加工等方面研究仍需进一步加强。