水体中黑碳对斑马鱼胚胎的生长发育危害识别

高雅倩，于凡芮，李蕾，陈建秋，刘艳华，郭瑞昕

(中国药科大学工学院，江苏 南京 211198)

黑碳(BC)通常指化石燃料和生物质燃料不完全燃烧后产生的碳质残留物[1]。在环境研究领域，BC常与“生物炭(Biochar)”和“烟灰(Soot)”混用[2-3]。受人类活动和自然因素的影响，BC普遍存在于水体、土壤、沉积物和大气中[4-6]。近几十年来，对于BC的研究主要集中在其对于气候效应和人体健康的影响。研究指出，BC颗粒能有效地吸收阳光导致局部大气层被加热进而致使地球变暖[7]，流行病学与毒理学研究表明，暴露于BC颗粒中与心血管和肺部疾病风险增加之间存在关联[8]。

此外，研究者发现BC能够去除土壤和水体中的有机或无机污染物[9-10]，其在环境修复方面的潜力引起了广泛关注，但对BC可能带来的负面影响关注较少。Elliston等[11]指出，向土壤中添加高比例的BC，会导致蚯蚓出现物理损伤和死亡，也有少量文献报道过BC对于水生生物，如大型溞和藻类具有毒性作用[12-14]，但这些研究设定的BC浓度过高，远远超出其在水体中的实际浓度。BC通常以溶解黑碳(DBC)和颗粒黑碳(PBC)2种形式存在于水体中[15]，淡水系统中DBC的质量浓度为1.94×10-3～2.77 mg/L[16]，故应进一步对该浓度下BC在水体中的危害进行研究。

斑马鱼具有繁殖数量多、发育速度快以及基因与哺乳动物相似度高等优点，是多种生物学学科中的脊椎动物模型[17]。在毒理学研究中，斑马鱼常用于评估化学品的生殖毒性、心血管和神经发育毒性等，在化学品风险评价方面具有重要作用[18]。为了探究BC在水体中的生物危害，现以斑马鱼胚胎为模式生物，检测并分析了胚胎在暴露于质量浓度为0(对照)，0.05，0.5，5 mg/L的BC后的生长发育指标，为BC在水生生态系统中的毒性风险评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

仪器：SMZ 1000体视显微镜 (日本Nikon公司)；GZP-300B恒温培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)；JP-080S超声波清洗机(广东洁盟超声实业有限公司)；Vario UNICUBE元素分析仪(德国Elementar公司)；FEI Tecnai F20透射电子显微镜(美国FEI公司)；Zetasizer Nano ZS90马尔文粒度电位仪(英国Malvern Instrument公司)；FTIR-8400S傅里叶红外变换光谱仪(日本Shimadzu公司)；UV-1800紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)。

材料：BC在实验室条件下模拟煤油燃烧制备获得。具体过程为，构建密闭容器，在容器下方设置进气口，容器侧上方设置出气口，控制气流流速以达到煤油不完全燃烧的目的，在上方放置的球形玻璃容器中加水以起到冷凝和收集BC的作用，向酒精灯中加入煤油并点燃，燃烧结束后用刷子轻扫并收集附着在玻璃容器壁上的黑色粉末获得实验使用的BC。斑马鱼胚胎E3培养基(5 mmol/L NaCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L MgSO4，pH值= 7.4)和斑马鱼胚胎(南京一树梨花生物科技有限公司)。

1.2 黑碳表征

利用透射电子显微镜观察BC的形貌；使用马尔文粒度电位仪测定在纯水介质中10 mg/L BC悬浮液的粒径和Zeta电位；使用傅里叶红外变换光谱仪分析BC表面含有的基团；使用元素分析仪测定制备的BC中元素的含量；使用紫外可见分光光度计获得10 mg/L的BC悬浮液的紫外可见光谱图。

1.3 实验设计

称取0.003 g BC，将其超声分散于300 mL E3培养基中，得到10 mg/L的母液，使用E3培养基进一步稀释获得0.05，0.5和5 mg/L的BC悬浮液。选择受精后5 h且发育正常的斑马鱼胚胎用于实验，暴露实验在6孔板中进行，每个孔中含有5 mL的BC悬浮液，放置30个胚胎，每个浓度组设置6个平行。将斑马鱼胚胎置于温度为(26±0.5)℃的培养箱中培养，光暗周期为14 h(光)/10 h(暗)。斑马鱼胚胎暴露总时长为144 h，实验期间，每天更换一半的暴露溶液并及时挑出死亡胚胎/幼鱼。用体视显微镜观察并记录斑马鱼胚胎/幼鱼的死亡率、体长、心跳、孵化率和畸形率。斑马鱼死亡率从开始暴露于BC后每24 h记录1次，直到实验结束。在72 h时，在室温下测定斑马鱼幼鱼体长并记录1 min内幼鱼的心跳次数。在72，96和120 h时分别记录胚胎的孵化率，在96和144 h时分别记录幼鱼的畸形情况。实验流程见图1。

1.4 数据统计分析

用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析检验，评价BC暴露组与对照组之间生物学参数的统计学差异，结果以平均值±标准偏差(SD)表示。p<0.05，视为有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 BC的表征

BC的表征数据见图2(a)—(f)。由图2(a)可见，BC呈球状或类球状，由多个颗粒连接而成，形态上以团聚体的形式存在，这与Wang等[19]的研究结果相似。 BC外貌上为黑色粉末，质地轻，其悬浮液具有一定色度。由图2(b)可见，BC在水中的粒径范围为190～615 nm，平均粒径为383.2 nm，BC在水相中的聚集体尺寸大于单个颗粒的粒径。Zeta电位是一个用于研究和预测胶体稳定性的参数[20]，Zeta电位(正/负)的数值越高，体系越稳定[21]，一般其绝对值>30 mV，认为悬浮液中粒子较稳定，没有聚集的趋势。由图2(c)可见，10 mg/L 的BC颗粒悬浮液在水介质中的Zeta电位数值为(-21.3±5.34)mV，这表明BC颗粒表面含有负电荷，并且BC悬浮液体系不稳定，具有一定的絮凝倾向。由图2(d)可见，在该条件下合成的BC中明显无官能团。由图2(e)可见，BC绝大部分由碳、氢、氧元素组成，还含有少量的氮和硫元素，其中碳元素比例最高，达90.62%。物质的元素比例与生产原料和方式有关，与生物质材料稻草秸秆制备的BC相比，以煤油为原料制备的BC碳元素比例更高[22]。由图2(f)可见，BC在 200～600 nm波长区域内无明显吸收峰。

图2 BC的表征数据

2.2 BC对斑马鱼胚胎发育的影响

BC对斑马鱼死亡率、孵化率、心率和体长的影响见图3(a)—(e)。由图3(a)可见，斑马鱼胚胎死亡主要出现在暴露初期，24 h后，对照组死亡率平均值为12.22%，0.05 和0.5 mg/L BC暴露组的死亡率与对照组相比大幅度增加(p<0.001)，在48 h时，5 mg/L BC暴露组的死亡率相较于24 h的死亡率提高了约54.64%，后期死亡率变化较小，基本维持不变，这可能是胚胎相对于幼鱼而言，对于外界刺激的敏感程度更高导致的，在暴露终点时，3个不同质量浓度暴露组的斑马鱼胚胎死亡率都显著增加，其中，0.05 和0.5 mg/L暴露组胚胎的死亡率约为对照组死亡率的2倍。由图3(b)可见，BC会吸附在斑马鱼胚胎外的绒毛膜表面，并且随着质量浓度的提高，绒毛膜表面沉积的BC附着量也在增加。Chen等[23]的研究指出，氧化石墨烯能吸附并包裹在斑马鱼胚胎的绒毛膜上，通过阻断绒毛膜的孔管导致胚胎明显缺氧。由于BC和氧化石墨烯一样是碳基材料，因此，推测BC附着在斑马鱼胚胎的绒毛膜表面使其缺氧可能是导致胚胎死亡的原因之一。以上结果表明，BC对斑马鱼早期暴露具有明显的致死影响，表现出较高的毒性作用。由图3(c)可见，大部分斑马鱼胚胎在72 h开始孵化成幼鱼，96和120 h的孵化率相差不大，当暴露于BC 120 h后，与对照组的孵化率[(84.45±5.84)%]相比，暴露组斑马鱼的孵化率都显著降低，0.05，0.5和5 mg/L BC暴露组的孵化率降低为(74.00±5.48)%，(73.34±4.71)%和(77.78±5.44)%，这表明BC暴露对斑马鱼胚胎的孵化存在抑制作用。由图3(d)可见，暴露于BC使得斑马鱼幼鱼的心跳增加，Bangeppagari等[24]研究的氧化石墨烯对斑马鱼胚胎心率的影响也表现出类似的趋势。值得注意的是，只有0.5 mg/L BC暴露组的斑马鱼心跳与对照组相比表现出显著性差异(p<0.05)。在实验过程中观察到，5 mg/L的BC会出现黑色絮凝状物质，BC颗粒聚集可能会降低其进入斑马鱼体内的概率，使得高质量浓度BC暴露组的斑马鱼心率增加并不是最显著的，这也表明BC自身的聚集作用会对其毒性有一定影响。BC颗粒物是大气中PM2.5的成分之一[25]，有研究指出，PM2.5暴露与斑马鱼心脏缺陷有关，会改变与心脏发育和功能相关的基因表达，从而诱导心脏发育畸形并影响心率[26]。BC是否会通过这样的机制影响斑马鱼心率还需要进一步研究。由图3(e)可见，随着BC质量浓度的提高，斑马鱼幼鱼的体长呈现出逐渐降低的趋势，0.5 和5 mg/L暴露组与对照组相比具有显著性差异(p<0.01)。

注：与对照组相比，*为p<0.05，**为p<0.01，***为p<0.001。图3 BC对斑马鱼死亡率、孵化率、心率和体长的影响

2.3 BC对斑马鱼畸形的影响

BC对斑马鱼幼鱼畸形的影响见图4(a)(b)。由图4(a)可见，BC暴露导致斑马鱼幼鱼在形态上表现出明显的畸形，例如脊柱弯曲、尾部缺陷和心包水肿等。另外，在144 h时，5 mg/L BC组与其他3组相比，斑马鱼眼睛部位出现发育不良的情况，这可能是由于BC颗粒是黑色的，具有一定的遮光作用，而光在斑马鱼眼部发育的过程中起着重要的作用[27]。Shi等[28]研究碳纳米颗粒对斑马鱼胚胎的毒性时也发现了相似的结果，通过转录测序分析发现碳纳米颗粒暴露导致斑马鱼的光传导通路的表达发生改变，并指出后续可利用基因敲除模型进一步探讨其影响斑马鱼眼睛发育的作用机制。由图4(b)可见，随着BC暴露时间的延长，斑马鱼幼鱼畸形率有所增加，144 h的畸形率大于96 h的畸形率。另外，幼鱼的畸形率具有浓度依赖性，呈现出随BC质量浓度的增加而增加的趋势。实验中观察到，对照组的斑马鱼幼鱼也出现了少量畸形的情况，这与个体差异有关。与对照组相比，144 h时0.05，0.5和5 mg/L BC暴露组使斑马鱼的畸形率分别增加了0.56%，1.40%和3.90%，只有5 mg/L BC暴露组对于斑马鱼幼鱼的致畸作用表现出显著影响(p<0.05)。碳质材料诱导斑马鱼畸形的作用机制主要包括影响氧化应激和基因表达等。孙晶等[29]研究了氧化石墨烯、碳纳米管和氧化石墨烯量子点3种材料对斑马鱼幼鱼的毒性，发现不同材料染毒组斑马鱼体内活性氧物质的含量较对照组显著上升，这与本实验中暴露组较对照组畸形率增加的趋势一致。Zou等[30]指出氧化石墨烯导致斑马鱼畸形的原因可能与肌动蛋白纤维和细胞骨架形成相关的蛋白下调存在关联，暴露后会改变与线粒体膜呼吸链相关的抗氧化酶和蛋白质水平诱导氧化应激和线粒体疾病。因此，若要进一步了解BC使得斑马鱼畸形的原因，可从暴露后斑马鱼的氧化应激水平和相关的基因表达进行研究。

注：与对照组相比，*为p<0.05，**为p<0.01，***为p<0.001。图4 BC对斑马鱼幼鱼畸形的影响

2.4 BC对斑马鱼生长发育影响的综合评价

雷达图是描述多维参数的一个图形方法，常用于多项指标的综合分析，能够完整直观地展示出多个参数中哪个参数更为敏感。例如，笔者前期研究中采用此统计方法综合分析了分别暴露于BDE-47、6-OH-BDE-47和6-MeOH-BDE-47这3种四溴联苯醚中的大型溞的子代数量、体长，乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，评价了3种不同污染物暴露后这些指标的差异敏感程度[31]。刘旺等[32]用雷达图分析了2,4-二叔丁基苯酚对斑马鱼幼鱼在光/暗周期中的游动加速度、游动距离以及活动频率等行为参数的影响，发现在光周期中，2,4-二叔丁基苯酚对加速度的影响更为显著。

本研究中，也采用雷达图分析了BC暴露后斑马鱼早期生长发育指标(死亡率、孵化率、心跳、体长和畸形率)的变化情况以及斑马鱼不同指标对BC暴露的影响敏感度。将144 h死亡率、144 h畸形率、72 h体长、72 h心率以及120 h孵化率5个变量间进行对比，相较于对照组，BC暴露组对斑马鱼的生长发育产生了显著影响, 并且在不同指标的影响上存在较大差异。BC暴露对斑马鱼生长发育影响的综合评估见图5(a)—(d)。由图5可见，各项指标中，对照组与BC暴露组在死亡率和畸形率这2个参数上存在明显差异，即斑马鱼死亡率和畸形率对BC胁迫的反应最为敏感。在Chen等[23]的研究中，氧化石墨烯胁迫下斑马鱼的畸形率是多个生长发育指标中受影响最大的，1 mg/L 的氧化石墨烯就会引起斑马鱼的畸形率显著增加，但0.01，0.1，1，10和100 mg/L 5个质量浓度组的氧化石墨烯对斑马鱼死亡率都未见明显影响，通过共聚焦显微镜实时监测发现，氧化石墨烯会进入胚胎，用石蜡切片检测暴露96 h后斑马鱼胚胎中氧化石墨烯的定位，发现氧化石墨烯主要聚集在眼睛、心脏、卵黄囊和尾巴周围。有研究指出，氧化石墨烯边缘尖锐，附着在胚胎绒毛膜表面会对其造成物理破坏和损伤[33]，而BC为小颗粒聚集体，未见锋利的边缘，对绒毛膜产生物理损伤的可能性较小，但BC是否会在胚胎还未孵化时就进入体内从而造成幼鱼的畸形率增加，需要进行进一步探究。

图5 BC暴露对斑马鱼生长发育影响的综合评估

3 结语

煤油源BC暴露会对斑马鱼胚胎的生长发育造成负面影响，导致其孵化率和体长降低，心率和死亡率升高，并对斑马鱼形态上产生明显的致畸作用。今后还需要进一步研究以确定BC暴露诱导斑马鱼发育毒性的作用机制，这有助于更充分地理解BC在环境中的毒性效应。同时，不同来源的BC所具有的表面基团、形态等有所差异，综合分析BC进入水体后所产生的毒性效应，也须关注BC自身形态结构的影响。