基因加倍对棉花线粒体atpA基因RNA编辑率的影响

张晓，李才华，王婧，张兰兰，牟晓雨，王昕玥，甘刘美，周鹏展，张锐

1.长春理工大学生命科学技术学院，长春130022；

2.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

RNA编辑现象普遍存在于植物线粒体基因组的蛋白编码基因中，并且根据选择压强度的不同而有完全编辑和部分编辑之分。植物线粒体基因组中有的基因是多拷贝基因（加倍基因），那么同一个基因不同拷贝的RNA编辑情况如何，目前尚无相关报道。本团队前期研究发现，棉花细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterile，CMS）系和保持系线粒体基因组中atpA基因各有两个拷贝，但每个拷贝的RNA编辑率差异尚不清楚［1］。本研究将分析两系atpA基因每个拷贝的RNA编辑率差异，这对探究植物线粒体基因表达调控（核质互作）、揭示棉花细胞质雄性不育机理具有重要意义。

植物线粒体基因组中的RNA编辑现象特指C-U RNA编辑。它是植物线粒体基因表达的必需步骤之一，属转录后加工范畴，主要发生在编码蛋白的基因中，通常位于密码子的第一、二位，导致编码的氨基酸发生改变［2］。RNA编辑后，表达的蛋白质与其他物种同源性更高［3］。目前已在甜菜［4］、油菜［5］、葡萄［6］、水稻［7］、拟南芥［8］、海枣树［9］、棉花［10］、苏铁［11］等植物线粒体基因组中分别发现了370、427、445、446、456、592、692、1 084个RNA编辑位点。拟南芥456个位点中位于蛋白编码区、非编码区（内含子、5'非翻译区和3'非翻译区）的分别是441、15个［8］。葡萄445个编辑位点中位于蛋白编码区、非编码区的分别是401、44个，位于蛋白编码区的401个位点中76%是部分编辑［6］。

PPR蛋白在RNA编辑中发挥重要作用，它们是植物中比较保守的由串联排列的35个氨基酸构成的一类蛋白［12］，是目前公认的反式作用编辑因子［13］，参与了细胞器RNA的成熟过程，并组成一个大的家族来负责植物细胞器中所有的RNA编辑事件。近年来，通过对突变体的研究，在拟南芥中已经发现了25种PPR蛋白参与RNA编辑［14-33］。目前，水稻、高粱和玉米等作物中也鉴定出大量的PPR蛋白，它们大多是不同物种间的同源 基 因［34］。PPR蛋 白 以 自 身 做 为RNA编 辑酶［13，35］、或充当RNA编辑酶募集者［36］的方式参与线粒体RNA编辑。

基因加倍是指在同一个基因组内存在2个以上拷贝的同源基因序列，是一种普遍的生物现象。在已完成全测序的生物基因组中，存在大量的加倍基因［37-38］，它们在基因组分化和生物进化中发挥重要作用［39］。植物线粒体基因组结构复杂，存在基因重排、重组现象，导致产生较多重复序列，位于长重复序列上的基因便成为加倍基因。不同植物线粒体基因组中的加倍基因数目从一个到十几个不等［40-45］。

本团队研究发现，棉花CMS系和保持系线粒体atpA基因各有两个拷贝：一个是完整的，一个是3'截短的，属于基因加倍现象。但该基因加倍对RNA编辑的影响尚不清楚。本研究拟对两系atpA双拷贝基因进行DNA序列解析和RNA编辑分析，研究基因加倍对RNA编辑率的影响，以期为植物线粒体基因表达调控提供实验数据，并探讨RNA编辑率与棉花细胞质雄性不育之间的关系。

1 材料与方法

1.1 植物材料

陆地棉CMS系P30A，保持系P30B。P30B是陆地棉品种；P30A是P30B与104-7A多代回交得到的高代不育系；P30B与P30A的核背景一致。所有材料种植于大田或人工气候培养箱。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取5 g新鲜叶片用液氮速冻后，快速充分研磨成粉末，转入50 mL离心管中，加入20 mL提取液［100 mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0），1.5 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA（pH8.0），2%CTAB，2%PVP40，2%β-巯基乙醇］，65℃水浴40 min，期间温和颠倒混匀数次，然后加入20 mL氯仿∶异戊醇（24∶1）振荡混匀，12 000 r·min-1离心10 min，后续步骤参照张晓等［46］的方法。

1.2.2 Southern blot取40 μg总DNA，分别以300 UEcoRⅠ和HindⅢ（美国Promega公司）充分酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳，经脱嘌呤、变性步骤后，以10×SSC为转膜缓冲液用真空转印仪（Vacuum Blotter 785，美国Bio-Rad公司）将DNA转印到Hybond N+尼龙膜（美国Amersham Pharmacia Biotech公司）上，用紫外交联仪（CL-1000 UV Crosslinker，美国UVP公司）交联1 min（剂量约为0.1 J·cm-2）。探针标记、杂交、检测步骤参照张晓等［47］的方法。

取1 μgatpA基因DNA片段（所用引物见表1中的atpAF和atpAR）为模板进行标记。同时将Gene-ruler DNA ladder Mix SM0331（美国Thermo公司）进行标记做为分子量参照。尼龙膜在杂交炉（美国Hybaid公司）中42℃杂交至少20 h，探针浓度为25 ng·mL-1。X光胶片曝光30 min后冲洗胶片。

1.2.3 反向PCR法结合Tail-PCR法扩增atpA5'和3'侧翼序列 具体方法参照张晓等［1］的方法。

1.2.4 总RNA提取与Northern blot分析 花蕾总RNA的提取采用RNAout Plant试剂盒（Tianze，China）。进行Northern blot实验时，RNA样品在1.2%甲醛变性胶中60 V电泳2 h，后续步骤同1.2.2。

1.2.5 RT-PCR与cRT-PCR RT-PCR实 验 参 照张晓等［46］的方法。RT-PCR所用引物序列见表1。cRT-PCR参照Kuhn等［48］和张晓等［46］的方法，所用特异反向引物为表1中的atpAIF和atpAIR。

表1 研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 结果与分析

2.1 棉花CMS系和保持系atpA基因结构

Southern blot实验在棉花保持系和CMS系中各获得两个atpA基因杂交条带（图1）。保持系、CMS系的EcoRⅠ限制片段长度分别是2.2和5.1 kb、2.2和3.3 kb；HindⅢ限制片段长度分别是8.5和11.7 kb、9.1和11.7 kb。通过反向PCR和Tail-PCR技术克隆到这些片段的具体序列，结果发现，两系各含有2个atpA基因拷贝：一个是完整的，一个是3'截短型的（图2）。保持系中的完整拷贝和截短型拷贝分别命名为（N）atpA-1（11 689 bp）和（N）atpA-2（8 501 bp）；CMS系中相应的拷贝分别命名为（S）atpA-1（11 658 bp）和（S）atpA-2（9 139 bp）。上述4段序列具有相同的5'侧翼区（图2），并且一致性序列至少延伸到atpA起始密码子上游-4 351 bp（HindⅢ位点）处。

图1 陆地棉细胞质雄性不育系、保持系总DNA的Southern blot分析Fig.1 Southern blot analysis of total DNAs of CMS,maintainer line of Gossypium hirsutum L.

（N）atpA-1和（S）atpA-1含有完整的atpA基因编码序列（1 524 bp），并具有相似的3'延伸区，但是在atpA终止密码子下游161～212 bp区域，存在一个SSR位点。该位点在保持系中是（TAA）7（TA）6，在CMS中是（TAA）3（TA）2。

（N）atpA-2和（S）atpA-2含有3'截短型的atpA基因，但是断点不同：（N）atpA-2是在atpA编码序列的第1 352 bp处截断；（S）atpA-2是在第1 336 bp处截断（图2）。二者序列在atpA编码区一致，但是从断点处往下开始出现长度分别为515和555 bp的特异嵌合序列。N515和S555嵌合序列后面，又分别存在一段2 010 bp（或2 016 bp）的一致序列。在该一致序列之后，又开始出现差异，这段差异序列一直延伸到各自HindⅢ位点处，并继续往下延伸，总长度未知。经ORFfinder预测，（N）atpA-2和（S）atpA-2中atpAORF分别是1 947和1 821 bp，即终止密码子分别位于各自断点下游595、485 bp处。

图2 棉花CMS和保持系中atpA基因HindⅢ限制性片段Fig.2 HindⅢrestriction fragments of atpA gene in CMS and maintainer line of cotton.

2.2 atpA基因的转录分析

为研究棉花两系中atpA基因的两个拷贝是否都转录，我们合成了针对每个拷贝的特异引物，并进行RT-PCR分析。结果显示，4个拷贝的cDNA都检测到，这说明尽管3'末端大约1/8的编码区被截短，但（N）atpA-2和（S）atpA-2都能够转录（图3）。两系的atpA全长拷贝都是1 524 bp；截短型拷贝在保持系中预测开放阅读框（open reading frame，ORF）是1 947 bp，在CMS系中预测开放阅读框是1 821 bp。

图3 棉花CMS和保持系中atpA基因的RT-PCR分析Fig.3 RT-PCR analysis of atpA gene in CMS and maintainer line of cotton

利用cRT-PCR法克隆到CMS系atpA基因两个拷贝的转录本全长。完整atpA基因的cDNA全长1 807 bp，包含1 524 bp的完整atpA基因。主要的转录起始位点位于-81 bp处（表2），主要的转录终止位点位于+200 bp处（表2）。

CMS系截短型atpA基因的cDNA全长2 150 bp，其中包含一个1 821 bp的ORF，该ORF由1 336 bp的atpA编码序列和其下游485 bp序列组成。主要的转录起始位点位于-81 bp处（表2）。主要的转录终止位点位于终止密码子（TAG）下游+249 bp处（表2）。

表2 棉花CMS系全长和截短型atpA基因转录起始位点和终止位点情况Table 2 Start and termination sites of transcripts of intact and truncated atpA gene in CMS line of cotton

由此可见，CMS系atpA基因两个拷贝转录起始位点均位于-81 bp附近，表明二者启动子基本相同。

2.3 atpA基因的Northern blot分析

为研究atpA基因的转录本情况，以atpA核心序列为探针进行了Northern blot分析，发现CMS系和保持系均有4个转录本：最长的1个转录本丰度最高、较短的3个转录本丰度均较低，且两系之间带型无明显差异（图4）。这说明虽然不育系P30A、保持系P30B都有特异截短型的atpA转录本，但可能由于电泳时间不够长、转录本的大小差异不明显或者表达量很低，因此用Northern blot方法检测不到差异。

图4 棉花CMS和保持系atpA基因Northern blot分析Fig.4 Northern blot analysis of atpA gene in CMS and maintainer line of cotton

2.4 棉花atpA cDNA中的RNA编辑位点

利用特异引物对P30B和P30AatpA全长和截短型拷贝进行了RT-PCR分析。将cDNA序列和基因组序列进行比对发现，atpA全长拷贝中存在6处C-U RNA编辑位点，它们的核苷酸位置（对应密码子、对应氨基酸位置、对应氨基酸变化）分别是：1 039（CCC-UCC、347、Pro-Ser）、1 064（UCGUUG、355、Ser-Leu）、1 216（CUU-UUU、406、Leu-Phe）、1 292（CCG-CUG、431、Pro-Leu）、1 415（CCACUA、472、Pro-Leu）、1 484（CCA-CUA、495、Pro-Leu）bp处（图2）。这6处位点4个发生在密码子的第二位，2个发生在密码子的第1位。这些位点对应在ATPA蛋白的C末端区域，导致6个氨基酸发生改变，其中3个脯氨酸和1个丝氨酸都变成亮氨酸，使得多肽中更容易形成α-螺旋，同时提高了棉花ATPA蛋白与其他物种ATPA蛋白的相似性。

在提莫菲维小麦、普通小麦［49］、黑小麦［50］、月见草［51］和甜菜［52］线粒体atpA转录本中也分别发现了6、6、6、4、3个RNA编辑位点。不同植物atpA转录本的RNA编辑通常发生在同样的位点，有的没有发生编辑是因为它们在基因组水平上已经完成编辑。例如，第472位氨基酸对应的序列在提莫菲维小麦、普通小麦、黑小麦基因组上已经是棉花编辑后的序列；同样在棉花基因组上第10、324、393位氨基酸对应的序列已经是提莫菲维小麦、普通小麦、黑小麦RNA编辑后的序列（表3）。

表3 棉花atpA编辑位点与其他植物的比较Table 3 Comparison of cotton atpA editing sites with those of other plants

在两系截短型拷贝中，分别存在4个RNA编辑位点：第1 039、1 064、1 216、1 292 bp。这4个位点与全长拷贝中的完全一样。

同时，在P30A全长atpA拷贝终止密码子下游+78 bp处（3'-UTR区），存在一个编辑位点，该位点的编辑率是41%（7/17），属于部分编辑。

2.5 保持系和CMS系atpA基因RNA编辑率的差异

对cDNA克隆子进行测序发现，棉花atpA基因的RNA编辑率在不同系和不同拷贝间存在明显差异（表4）。

表4 棉花CMS系(S)和保持系(N)atpA基因完整拷贝和截短型拷贝的RNA编辑率比较Table 4 Comparison of RNA editing rates of intact and truncated copies of atpA gene in CMS line(S)and maintainer line(N)of cotton

（N）atpA-1中6个位点的编辑率都是100%，说明保持系中完整atpA基因是完全编辑。（S）atpA-1中6个位点的编辑率分别是100%、85%、100%、92%、100%、100%，即第2（S-L）、4（P-L）位点的编辑率不足100%。这两处编辑位点的作用都是改变氨基酸序列，特别是第4位点，能够将脯氨酸修正为亮氨酸，并且从表3可看出，每一种植物在此处都应是亮氨酸，此处编辑不足，可能导致大约8%的转录本是“不合格”的。这种“不合格率”是否会影响CMS系中线粒体ATP合酶的正常功能尚未知。

（N）atpA-2和（S）atpA-2的RNA编辑率存在明显差异。（N）atpA-2中4个位点的编辑率分别是55%、37%、55%、27%，说明保持系截短型atpA基因是部分编辑，且编辑率特别低。但（S）atpA-2中4个位点的编辑率分别是100%、90%、100%、100%，接近完全编辑，整体编辑率甚至超过（S）atpA-1。特别是第4个位点，完整拷贝中编辑率是92%，截短型拷贝中是100%。

综上，保持系中atpA基因完整拷贝编辑率较高（100%），截短型拷贝编辑率较低（60%以下）。而CMS系中完整拷贝和截短型拷贝编辑率均较高（接近100%）。据此推测，atpA基因RNA编辑率可能与棉花CMS之间有相关性。

3 讨论

高等植物线粒体基因组中的多拷贝基因通常都是位于长重复序列上［53］。本文中的棉花双拷贝atpA基因也是如此。在每个棉花品种中，全长拷贝和截短型拷贝之间的重复序列都在5 800 bp以上。在Genbank中进一步分析发现，该重复序列可能位于与亚洲棉线粒体基因组中的反向重复序列R1（63.789 kb）［54］、海岛棉线粒体基因组中的正向重复序列R1（63.904 kb）［55］、三裂棉线粒体基因组中的正向重复序列R1（12.921 kb）［54］相似的长重复序列上。atpA基因位于长重复序列的3'端，此处是重组或重排位点，CMS系和保持系在此处存在明显序列差异。棉花线粒体atpA基因是研究基因加倍的一个很好的模型，因为两个拷贝的3'末端有特异序列，所以可以设计特异引物对每一个拷贝进行扩增分析。

植物线粒体基因组结构复杂多样，有环形（主环、亚环）、线形等多种形式［56］。Iwahashi等［57］提出水稻线粒体基因组由5个亚环构成，每个亚环都与其他1、2个环共享一段同源重复序列，某些重复序列会引起分子内或分子间重组事件，使DNA主环变为2个亚环分子，或使2个亚环形成一个主环，使线粒体基因组结构呈现异质性［58-60］。目前已公布的棉属植物线粒体基因组都是一个主环结构，推测atpA基因的两个拷贝是位于同一个主环内。棉花线粒体基因组是否存在亚环，以及atpA基因是否有可能位于不同的环状基因组分子中，目前尚无相关报道。

高等植物线粒体基因组中几乎每一个编码蛋白的基因中都存在RNA编辑。RNA编辑位点绝大多数出现在基因编码区，少部分在基因间隔区或非偏码区。编码区的RNA编辑位点基本都是完全编辑，而非编码区的编辑位点通常是部分编辑［8］。这说明，编辑位点的选择遵循“节约”原则。需要编辑的地方因为具有功能所以受到的选择压较大而编辑，不需要编辑的地方因为失去功能所以受到的选择压较小而不编辑，这样的节约原则也影响了基因的表达。

CMS系和保持系中atpA基因各有两个拷贝，通过对P30A中atpA转录本5'末端进行分析表明，完整拷贝和截短型拷贝转录本的5'末端是基本相同的，说明二者启动子基本相同，即启动子对这两个拷贝的RNA编辑率的影响可能不大。

完整atpA基因的RNA编辑位点在保持系和CMS系中相同，且6个位点的编辑率都接近100%。但截短型拷贝的RNA编辑率在保持系和CMS系间差距较大：保持系的编辑率很低，在27%～55%之间；而CMS系的却很高，接近100%。加倍基因的命运通常有新功能化、亚功能化和去功能化3种［61］。保持系atpA截短型拷贝的RNA编辑率特别低，可能说明该基因（加倍基因）的功能可有可无，所受选择压很低，逐步退出调控网络，为亚功能化或去功能化；相反，CMS系中该拷贝的编辑率很高（接近100%），可能意味着该基因仍有明确的功能，所受选择压较大，为新功能化。CMS系中atpA截短型拷贝的RNA编辑率非常充分的原因，即为何CMS系体内要动用这个拷贝、对之施加这么高的选择压让其充分编辑，可能是因为CMS系中完整拷贝的6个RNA编辑位点中有2个位点的编辑率不足100%，导致不能产生足够多的正确的ATPA蛋白，需要再动员截短型拷贝来继续生产ATPA相似蛋白来补充，但具体结论需要我们进一步深入研究。

RNA编辑既受所在基因组序列的影响，也受细胞核的调控影响［62］。本研究内容属于前者，因为P30A和P30B是同核异质系，细胞核是相同的，atpA基因RNA编辑的差异主要受其所在线粒体基因组序列的影响。后续研究可以将恢复系和F1代也引入分析。比如不育系P30A和恢复系的细胞质（包括线粒体基因组）是相同的，但细胞核不同，因此未来可以将两者进行比较，来探究细胞核对RNA编辑的影响。