心可舒调控TGF-β1和间质胶原酶表达抑制心肌纤维化的机制

★ 饶斌 涂艳 李芬 陈传军（.江西卫生职业学院 南昌 005；.江西省惠民医院 南昌 0046；.南昌乐悠生物科技有限公司 南昌 0046）

适应不良的病理变化导致心肌梗塞后心脏重塑过程中的心力衰竭，包括心肌细胞肥大，炎症和纤维化增强[1-2］。一些证据表明心脏成纤维细胞增殖和过度的细胞外基质沉积诱导心肌纤维化并导致心室功能障碍，心室扩张和心力衰竭[3］。肌成纤维细胞从成纤维细胞和其他细胞类型转化而来，在纤维化中发挥重要作用[4］。然而，心肌纤维化的确切病因和可用的药理学干预被消除仍然很少被研究。因此，迫切需要寻求用于改善心肌纤维化功能恢复的新型治疗策略。以前的强化研究已经注意到转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导的各种疾病的细胞外基质和纤维化，包括心脏成纤维细胞-肌成纤维细胞的转变[5-6］。TGF-β1功能由TGF-βI型和II型受体介导[7］。在一些研究中，已经证明各种中药材料可以安全地抑制促炎和促纤维化途径并控制心肌纤维化[8］。心可舒主要生物活性成分丹参、葛根、木香、三七、山楂，在传统中医中被广泛使用[9］。它具有很少的副作用，可用于治疗心血管疾病，脑血管疾病，糖尿病和糖尿病并发症。最近研究发现，心可舒通过其抗炎，抗氧化作用证明它对心脏重塑具有治愈和抗纤维化作用[10］。鉴于以上几点，我们认为心可舒可通过抑制TGF-β1信号通路和间质胶原酶表达来消除心脏纤维化。为此，我们开发了一种小鼠模型来研究心可舒是否是心肌梗塞诱导的心脏纤维化的潜在治疗化合物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 从动物中心购买体重18～22 g的C57BL/6J雄性小鼠（购自军事医学科学院实验室合格证号为SCXK-〈军〉2012-0004），在温度（24 ℃）和正常光明/黑暗循环（上午8:00～晚上8:00的光照）下饲养动物，自由获取食物和水。

1.1.2 心肌梗塞模型 通过LAD冠状动脉的手术结扎产生小鼠心肌梗塞（心肌梗塞）模型。简而言之，在用戊巴比妥钠（50 mg/kg；购自上海信裕生物科技有限公司，批号2015a-213695）初始麻醉后，将小鼠与气管插管一起孵育。然后打开胸腔以暴露心脏，并将8-0丝线缝合用于LAD冠状动脉的永久性结扎。缝合线通过左耳廓尖端下方约2～3 mm处。用6-0丝线缝合将胸部逐层封闭。通过左心室前壁的苍白颜色证实了心肌梗塞。

1.2 实验分组

将20只存活的心肌梗塞小鼠和10只假小鼠（未结扎的胸廓切开术）分成3组，每组10只：假手术组（假小鼠腹腔注射等体积的生理盐水28 d）（对照组1）；心肌梗塞组（心肌梗塞小鼠腹腔注射等量生理盐水28 d）（对照组2）；心肌梗塞+心可舒组（心肌梗塞小鼠腹膜内每日注射200 mg/kg心可舒，共28 d；心可舒购自四川科瑞德制药股份有限公司，批号2018YBZ030-0508）（观察组）。在心肌梗塞手术后48 h开始治疗。心肌梗塞后4周，每组动物用二氧化碳处死。心脏被采取进一步检查。对于组织学研究，在麻醉后用20 mL的0.01 mol/L PBS灌注心脏，然后灌注30 mL的4%多聚甲醛。然后将心肌样品在4 ℃下浸入4%多聚甲醛中另外24 h并包埋在石蜡中。

1.3 方法

1.3.1 组织病理学检查 将心肌组织样品用4%聚甲醛固定，用水洗涤，用醇脱水，包埋在石蜡中并切成切片（厚度，4 μm）。根据Masson's染色试剂盒（南京森贝嘉生物科技有限公司，批号020581230）染色切片。制造商的说明书并在光学显微镜下观察。

1.3.2 透射电子显微镜观察 将左心室心肌组织样品切成薄片并用2.5%戊二醛固定，用1%四氧化锇后固定，用磷酸冲洗液冲洗，用不同浓度的一系列丙酮（脱水，包埋并固化，并切成薄片（厚度，50～100 nm）。将超薄切片用3%乙酸铀酰（上海财富生物技术有限公司，批号ASS0206985）和硝酸铅（中国营口天韵工业精细化工有限公司，批号2015005289）在37 ℃下染色30 min。在透射电子显微镜下观察样品并保存图像。

1.3.3 通过免疫组织化学检测胶原蛋白I的表达 将心肌组织样品用4%聚甲醛固定，包埋在石蜡中，切成薄片（厚度，10 μm），脱蜡并水合。将切片与3%过氧化氢一起温育，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，用10%正常山羊血清在37 ℃下封闭10 min。在37 ℃下与兔多克隆抗胶原蛋白I（稀释度1∶100）一起孵育90 min，用PBS洗涤，在37 ℃下与第二抗体（稀释度1∶2 000）一起孵育15 min，用PBS洗涤，在37 ℃下用辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白孵育20 min，用PBS洗涤，用显色试剂着色，用苏木精在37 ℃染色。保持20 min，用酒精脱水并用中性树脂密封。

1.3.4 蛋白质印迹分析 在含有蛋白酶抑制剂的细胞透析缓冲液中提取总蛋白质，并使用BCA蛋白质测定试剂盒定量。通过配备有10%SDS-PAGE的电泳使蛋白质变性，分离（40 μg蛋白质/泳道），并转移至PVDF膜（200 mA，110心肌梗塞n）。用含有5%脱脂乳的吐温-20在37 ℃下将Tris缓冲盐水封闭膜1 h。将膜在4 ℃下与以下适当浓度稀释的一抗孵育过夜：基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP8）（1∶400），MMP13（1∶400），基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP1）（1 ：400），Beclin 1（1∶1 000），Atg3（1∶1 000）和Atg7（1∶1 000）。用TBST缓冲液洗涤3次后，将膜与二抗（1∶8 000）在37℃温育1 h。使用增强的化学发光检测试剂使条纹可视化，并使用Alpha Imager 2 200进行分析。GAPDH作为内部参考。

1.3.5 逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析 使用TRIzol试剂从各组小鼠的心肌组织中提取总RNA。使用紫外分光光度计测量提取的RNA的浓度，并用凝胶成像系统分析RNA的完整性。使用RT聚合酶链式反应试剂盒，用心肌梗塞-RNA特异性RT引物操作RT反应。进行RT-qPCR并在Thermo Scientific Piko-Real Real-Time PCR系统上分析。使用Taqman 心肌梗塞-RNA测定探针通过qPCR检测TGF-β表达水平，并使用U6作为定量的上样对照。 RT在以下条件下进行：37 ℃ 15 min，42 ℃ 50 min和85 ℃ 5 min。将获得的cDNA如下进行qPCR：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s 40个循环。使用2-ΔΔCt方法计算表达的相对定量。

1.3.6 统计分析 本研究中数据全部采用SPSS 20.0统计分析软件（美国IBM公司）进行处理；计量资料采用“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P＜0.05代表差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 3组心可舒对心肌梗塞小鼠心肌纤维化的影响

为了观察心肌组织样品中的组织病理学变化，使用Masson染色，蓝色染色显示心肌组织中的胶原纤维。与假手术组相比，在心肌梗塞组中观察到不规则排列的心肌细胞和增加的纤维化。在心肌梗塞小鼠用心可舒处理后，心肌纤维的不规则排列程度和心肌纤维化降低。见图1。

图1 3组心肌梗塞小鼠心肌纤维化Masson染色图

2.2 3组心可舒对Ⅰ型胶原表达水平的影响

通过免疫组织化学检测I型胶原蛋白的表达水平，旨在分子水平上阐明心肌纤维化。与对照组1比较，对照组2中I型胶原蛋白的表达水平增加（P＜0.05）。与对照组2比较，观察组中I型胶原蛋白的表达水平降低（P＜0.05）。见表1。

表1 3组胶原蛋白I的表达水平比较（ ±s，n=10）

表1 3组胶原蛋白I的表达水平比较（ ±s，n=10）

注：与对照组1比较，*P＜0.05；与对照组2比较，#P＜0.05。

组别 I型胶原蛋白观察组 1.94±0.15#对照组1 1.54±0.15对照组2 4.33±0.47*

2.3 3组RT-qPCR检测TGF-β1 mRNA的表达

TGF-β1被认为是与心肌纤维化密切相关的蛋白质。通过RT-qPCR检测TGF-β1 mRNA的表达，结果显示，与对照组1比较，对照组2中TGF-β1 mRNA的表达增加（P＜0.05）。与对照组2比较，观察组中TGF-β1 mRNA的表达降低（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 胶原蛋白I的表达水平

表2 3组TGF-β1 mRNA的表达量比较（ ±s，n=10）

表2 3组TGF-β1 mRNA的表达量比较（ ±s，n=10）

注：与对照组1比较，*P＜0.05；与对照组2比较，#P＜0.05。

组别 TGF-β1观察组 1.63±0.24#对照组1 1.25±0.09对照组2 3.87±0.16*

2.4 3组心可舒对间质胶原酶相关蛋白表达的影响

胶原合成和降解的程度与MMP和TIMP的平衡密切相关。通过蛋白质印迹检测MMP8、MMP13和TIMP1蛋白的表达水平，结果表明与对照组1比较，对照组2的MMP8和MMP13蛋白表达水平升高，而TIMP1的表达水平降低（P＜0.05）。与对照组2比较，观察组MMP8和MMP13的表达水平降低，TIMP1的表达水平升高（P＜0.05）。见图3、表3。

图3 心可舒对间质胶原酶相关蛋白表达的影响

表3 3组纤维化相关蛋白表达水平比较（ ±s，n=10）

表3 3组纤维化相关蛋白表达水平比较（ ±s，n=10）

注：与对照组1比较，*P＜0.05；与对照组2比较，#P＜0.05。

组别 MMP8 MMP13 TIMP1观察组 0.87±0.11# 1.04±0.07# 3.07±0.18#对照组1 0.54±0.12 0.85±0.06 3.54±0.33对照组2 2.25±0.21*2.33±0.14*1.15±0.23*

2.5 3组心可舒对心肌细胞自噬的影响

为了评估心可舒对心肌梗塞小鼠心肌组织自噬水平的影响，用透射电子显微镜观察各组的自噬体。在心肌梗塞组模型中观察到自噬体，而在假手术组中未发现可观察到的自噬体。为了进一步阐明心肌组织中的自噬水平，通过蛋白质印记检测自噬相关蛋白Beclin 1、Atg3和Atg7 蛋白表达，与对照组1比较，对照组2Beclin 1、Atg3和Atg7的表达水平增加（P＜0.05）。用心可舒处理后，Beclin 1，Atg3和Atg7的表达水平降低（P＜0.05）。见图4、表4。

图4 心可舒对心肌细胞自噬相关蛋白的影响

表4 3组自噬相关蛋白表达水平比较（ ±s，n=10）

表4 3组自噬相关蛋白表达水平比较（ ±s，n=10）

注：与对照组1比较，*P＜0.05；与对照组2比较，#P＜0.05。

组别 Beclin 1 Atg3 Atg7观察组 1.64±0.37# 1.36±0.08# 1.08±0.11#对照组1 1.52±0.16 1.15±0.12 0.85±0.06对照组2 3.43±0.28*2.87±0.21*2.59±0.14*

3 讨论

已经证实心可舒参与心血管系统的各种生理和病理过程的调节，并且某些研究表明心可舒在许多心脏损伤模型中发挥重要的保护作用，包括病毒性心肌炎，心肌缺血再灌注损伤和糖尿病性心肌病[11-13］。在这项研究中，我们提供证据表明心可舒通过减弱TGF-β1和MMP的表达来抑制心肌梗塞诱导的心脏纤维化。一些研究表明愈合和瘢痕形成过程和随后的纤维化始终是心肌梗塞的结果。心肌梗塞建立后第4周，心肌梗塞小鼠可观察到一系列病理改变，包括梗塞和边缘区心脏纤维化，I型胶原表达增加，而心可舒减弱心肌梗塞的病理变化，例如心肌组织中肌成纤维细胞募集，胶原合成和纤维化形成这些结果表明心可舒对心脏纤维化具有抗纤维化作用，这与其他组织中显示的结果一致。

目前，心肌梗塞的发病率逐渐增加，在心肌梗塞的发生和发展过程中，心肌可能发生各种病理改变，包括心肌纤维化。现有研究表明，心肌纤维化是心肌梗塞发病机制中的关键环节[14］。心肌纤维化是指心肌间质中过多的胶原纤维积聚，所有类型胶原的不成比例和胶原纤维的无序排列。在本研究中，观察到心肌梗塞模型小鼠心肌纤维紊乱，并且根据Masson染色，在模型组小鼠的心肌组织中也观察到心肌胶原蛋白积聚。此外，免疫组织化学显示模型组中的胶原蛋白I的表达水平与假手术组相比增加。MMPs是调节细胞外基质胶原蛋白聚集的重要因子，TIMPs作为MMPs的特异性抑制剂，可调节MMPs的活性，二者共同促进心肌组织中胶原蛋白的合成和降解[15］。现有研究表明，上调MMPs的表达水平和下调TIMP的表达水平可能导致心肌间质中胶原蛋白的合成并增加积聚，进一步导致心肌纤维化的发生。在本研究中，分子水平上的结果表明模型组小鼠心肌组织中MMP8和MMP13蛋白表达水平升高，TIMP1蛋白表达水平降低，表明不成比例的MMPs / TIMP1导致心肌梗塞模型小鼠心肌纤维化的发生。

已经证明自噬参与各种生理和病理过程。自噬是维持细胞稳态的关键机制，通过这种机制，受损的细胞器和未使用的蛋白质被破坏和再循环，以缓解细胞压力并提供营养物质以促进细胞存活。早期的一项研究表明，过量表达Beclin 1并且在压力超负荷的转基因小鼠的心肌中自噬水平升高，并且还可能引起病理性心肌重塑[16］。早期的研究也报道了心可舒参与细胞自噬的调节。此外，已经确定心可舒可以缓解心肌缺血再灌注损伤。本研究结果表明，心肌梗塞组小鼠自噬相关蛋白表达水平，如Beclin 1、Atg3和Atg7均高于假手术组（P＜0.05）。

TGF-β1通过激活成纤维细胞增生和促进细胞外基质中胶原的积累来促进心肌纤维化的发生。先前的一项研究发现，慢性铁超负荷小鼠心肌纤维化模型中TGF-β1的表达水平增加，并且在由心肌纤维化引起的心肌纤维化中TGF-β1的表达水平增加。同型半胱氨酸。TGF-β1的上调可能导致广泛的心肌纤维化并诱导自噬。本研究的结果表明，随着自噬水平的增加，心肌梗塞组小鼠心肌间质纤维化的机制可能与TGF-β1信号通路的激活有关。

总之，本研究结果表明，心可舒通过降低TGF-β和MMP表达，抑制细胞自噬并减轻心肌纤维化，这有助于研究心肌梗塞心肌纤维化的发病机制，为心肌梗塞的临床治疗提供了新思路。