TRAF6和OTUD5在结直肠癌中的表达情况及其临床意义

陈 妲， 吴江妮， 韦二丹， 丘新泽， 范俊华， 黄杰安， 刘诗权

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，病死人数约占全球肿瘤相关病死人数的9%[1]。目前，尽管CRC的诊断和治疗取得了进步，但CRC患者的存活率并未得到显著的改善，且50%以上的CRC患者在确诊时已发生区域性或远处转移。肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)是一种经典的E3泛素连接酶，它的泛素化活性受到多种因素的调节，并在磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、Wnt信号通路以及自噬中发挥重要作用，最终影响炎症反应、神经性疾病和癌症的发生[2]。TRAF6不仅可调控胃癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)并促进迁移，还可通过参与催化底物赖氨酸(lysine，Lys)63位点泛素化而促进CRC的迁移、侵袭和淋巴转移[3-4]。其E3泛素连接酶活性很大程度上依赖于K63的自聚泛素化和去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUB)作用，靶向调控TRAF6-K63的去泛素化酶作用可抑制肿瘤细胞的迁移[5]。有研究显示，DUB通过蛋白翻译后修饰(protein post-translational modification，PTM)调节EMT，进而调控肿瘤的转移[6-7]。卵巢肿瘤结构域蛋白去泛素化酶5(deubiquitinating enzyme ovarian tumor domain-containing protein 5，OTUD5)是近年来新发现的一种DUB亚型，OTUD5选择性地切割E3泛素连接酶TRAF3上Lys63连接的多聚泛素链。OTUD5内的离散泛素相互作用基序是结合并有效去除TRAF3泛素化作用所必需的，OTUD5通过阻断泛素化导致E3泛素连接酶与下游信号复合物分离，从而发挥负调节先天免疫反应作用[8]。研究表明，OTUD5在原发性肝癌组织中的表达显著下调，其降低水平与肿瘤的侵袭、转移和恶性表型相关，敲除OTUD5可促进裸鼠模型中肝癌的生长[9]。生物信息学分析发现，OTUD5在宫颈癌中的低表达与EMT和患者较短的生存期相关；但也有研究发现OTUD5在宫颈癌中高表达，促进宫颈癌细胞增殖[10-11]。另外也有研究发现OTUD5在肺癌、腺癌和宫颈癌中低表达，且与患者较短生存期相关；进一步分析发现OTUD5的低表达与肿瘤大小、恶性程度和淋巴结转移相关[12]。本研究通过免疫组织化学法和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测TRAF6和OTUD5在CRC中的表达情况，并探讨这两个因子的关联性，为CRC患者的诊断和预后预测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2017年3月至2018年3月在广西医科大学第一附属医院接受手术治疗的50例CRC患者的临床病理资料。选择其CRC组织及其对应的癌旁组织(距离肿瘤边缘>10 cm)。50例患者中男29例，女21例；年龄32～81岁，中位年龄62岁。TNM分期为Ⅰ期7例，Ⅱ期31例，Ⅲ期5例，Ⅳ期7例。出现淋巴结转移10例，未出现淋巴结转移40例；发生远处转移8例，未发生远处转移42例。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：(1)术前未接受过化学疗法或放射疗法；(2)行CRC根治术，且术后病理检查确诊为CRC。排除标准：(1)合并其他肿瘤者；(2)合并慢性疾病者；(3)有吸毒史者。以上所有组织标本的收集均经患者知情同意，本研究获医院医学伦理委员会批准(2021-0274)。

1.3免疫组织化学染色法 将组织标本进行石蜡包埋和组织切片，60 ℃烘箱烤片30 min，烘干后用二甲苯进行脱蜡，梯度洗脱脱水。分别滴加3% H2O2溶液、山羊血清封闭液(北京中杉金桥生物公司)至标本上，湿盒中室温静置15 min。滴加TRAF6或OTUD5一抗(TRAF6工作浓度为1∶400，美国Affinity公司；OTUD5工作浓度为1∶200，北京Bioss公司)，湿盒中4 ℃孵育过夜。复温，使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗3次，分别滴加生物素标记二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素(北京中杉金桥生物公司)，湿盒中37 ℃孵育15 min。PBS浸洗3次，5 min/次。采用3，3-二氨基苯联胺(diamino-benzidine，DAB)显色剂和苏木素进行复染，滴加适量中性树胶封片，于显微镜下进行观察。

1.4免疫组织化学染色结果判读 综合染色强度及阳性细胞数量进行半定量分析[13]，根据阳性细胞染色强度(A)：无明显着色为0分；细胞浆内出现淡黄色颗粒，明显高于背景为1分；出现较多棕黄色颗粒为2分；出现大量棕褐色颗粒为3分。每例随机观察5个高倍镜视野，计数500个细胞中染色阳性细胞所占比率(B)：阳性细胞数<5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；>50%为3分。A与B相加为最终得分，以0～2分判定为阴性(-)，≥3分判定为阳性(+)。

1.5细胞培养及转染实验 选择人正常结肠上皮细胞株NCM460、CRC细胞株HT29进行实验，细胞均购自中国科学院上海细胞培养库。使用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基进行HT29、NCM460细胞培养。细胞转染：HT29细胞以5×104cells/孔分别接种于6孔板，培养箱中培养24 h，待细胞生长融合度约达30%时进行转染。通过慢病毒转染将编码人TRAF6的慢病毒载体(Lenti- TRAF6-IRES-EGFP；5×108TU/ml)导入HT29细胞。另外，用空白载体(LTEN-EGFP，3×108TU/ml)转染HT29细胞。选择稳定转染的细胞进行进一步实验。培养箱条件设置为37 ℃，5% CO2。胎牛血清、青-链霉素混合液、DMEM培养基均购自美仑生物技术有限公司。过表达TRAF6表达的siRNA和阴性对照siRNA均由吉凯基因股份有限公司合成。

1.6RT-qPCR检测方法 采用总RNA提取试剂盒(Takara公司)提取细胞总RNA，并使用反转录试剂盒(Takara公司)将其反转录为cDNA。使用Power SYBR Green Master Mix(Genstar，中国北京)进行RT-qPCR，所用引物均由生工生物科技有限公司合成，引物序列见表1。以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt法计算TRAF6 mRNA、OTUD5 mRNA的相对表达量。重复3次独立实验。

表1 引物序列

2 结果

2.1CRC组织及其癌旁组织中TRAF6阳性表达率比较 TRAF6主要表达于腺上皮的胞浆和胞膜。见图1。CRC组织中TRAF6的阳性表达率为84.00%(42/50)，癌旁组织中TRAF6的阳性表达率为28.00%(14/50)，两组差异有统计学意义(χ2=31.818，P=0.000)。

图1 CRC组织及其癌旁组织中TRAF6的表达情况比较图(免疫组织化学染色，×400)

2.2CRC组织及其癌旁组织中OTUD5阳性表达率比较 OTUD5主要表达于腺上皮的胞浆和胞膜。见图2。CRC组织中OTUD5的阳性表达率为32.00%(16/50)，癌旁组织中OTUD5的阳性表达率为54.00%(27/50)，两组差异有统计学意义(χ2=4.937，P=0.026)。

图2 CRC组织及其癌旁组织中OTUD5表达情况比较图(免疫组织化学染色，×400)

2.3TRAF6、OTUD5表达情况与CRC患者临床病理特征的关联性分析结果 以CRC组织中TRAF6、OTUD5的表达情况进行分组。结果显示，TRAF6阴性组远处转移发生率高于TRAF6阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。OTUD5阴性组TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的人数比例大于OTUD5阳性组，且淋巴结转移和远处转移发生率高于OTUD5阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 CRC患者TRAF6表达情况与临床病理特征关联性分析结果[n(%)]

表3 CRC患者OTUD5表达情况与临床病理特征关联性分析结果[n(%)]

2.4TRAF6 mRNA与OTUD5 mRNA在CRC细胞及人正常结肠上皮细胞的表达水平比较 HT29细胞的TRAF6 mRNA表达水平显著高于NCM460细胞(t=6.960，P=0.000)，OTUD5 mRNA表达水平显著低于NCM460细胞(t=13.840，P=0.000)。见图3。

图3 HT29细胞与NCM460细胞TRAF6 mRNA、OTUD5 mRNA表达水平比较图

2.5TRAF6过表达对CRC细胞OTUD5 mRNA表达水平的影响 过表达TRAF6的HT29细胞[TRAF6(+)-HT29]中，OTUD5 mRNA表达水平显著低于正常HT29细胞(t=32.555，P=0.000)。见图4。

图4 TRAF6过表达HT29细胞与正常HT29细胞的OTUD5 mRNA表达水平比较图

3 讨论

3.1CRC是常见的恶性肿瘤，易发生远处转移，严重危害人们健康。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，具有介导蛋白的降解(Lys48位点)或调节其作为信号分子(Lys63位点)的生物学功能[14-15]。泛素化在CRC的发生、发展过程中发挥着重要的作用，被证实参与了从正常细胞向癌细胞的转化，以及癌细胞的侵袭和转移过程，对CRC患者的预后有重要影响[16-17]。

3.2泛素修饰的平衡受到E3泛素连接酶和DUB两者的调控，通常Lys63位点被泛素化后可修饰蛋白间相互作用，导致信号通路的活化或蛋白质的转运[2]。研究发现TRAF6作为E3泛素连接酶可催化ULK1、Beclin-1等自噬相关蛋白发生Lys63位点泛素化，进而激活自噬过程[18-19]。自噬在肿瘤发生、发展过程中起促进作用，涉及细胞癌前病变、EMT、浸润转移、肿瘤免疫微环境等[20]。TRAF6高表达与癌症进展密切相关，TRAF6以Lys63位点连接自噬相关蛋白不仅可诱导自噬，调控胃癌细胞EMT并促进肿瘤迁移，还可通过其泛素化位点124mut影响CRC的迁移、侵袭和淋巴转移[3-4]。另有研究显示，TRAF6可通过Lys48位点调控自噬选择性的β-catenin降解，抑制CRC细胞的侵袭和转移[21]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthetase kinase 3β，GSK3β)可通过诱发TRAF6的Try266位点发生磷酸化，促进TRAF6发生K48连接的多聚泛素化修饰，并启动其发生蛋白酶体途径的降解，进而抑制TRAF6介导的自噬选择性的β-catenin降解途径，促进CRC细胞发生侵袭和转移。因此，TRAF6两种泛素化功能位点在发生转移肿瘤中的自噬作用机制可能不同。本研究结果显示，TRAF6在人CRC组织、癌细胞株中高表达，且与CRC的远处转移具有关联性。

3.3DUB从目的蛋白中去除泛素的功能在肿瘤局部侵袭、扩散和远处转移等肿瘤生物学行为中起着重要作用[22]。有研究提示，低水平的OTUD5与肝癌、肺癌、宫颈癌的不良预后显著相关，是肿瘤发生侵袭、转移以及患者不良生存预后的独立影响因素[9-12]。本研究结果显示，OTUD5在CRC组织中低表达，且OTUD5阴性组TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的人数比例显著大于OTUD5阳性组，淋巴结转移和远处转移发生率显著高于OTUD5阳性组，这与相关研究结果相似。OTUD5是靶向去除TRAF6 Lys63泛素化的DUB亚型[8]，且与自噬相关。OTUD5可调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1/2(mammalian target of rapamycin complex 1/2，mTORC1/2)信号通路，敲除哺乳动物细胞的OTUD5基因可以诱导mTOR相关细胞自噬表型[23]，推测OTUD5通过去除靶蛋白中泛素分子，从而起到逆转TRAF6的作用；通过调控自噬信号通路，从而抑制肿瘤的发生、转移。本研究结果显示，HT29细胞过表达TRAF6会抑制OTUD5的表达，提示两者存在负关联，推测OTUD5可能通过结合E3泛素连接酶TRAF6并去除K63位点多聚泛素化，从而在CRC的发生、转移中发挥作用。

综上所述，TRAF6、OTUD5在CRC的发生、发展中发挥着重要的作用，其有望成为CRC诊断、治疗和预后预测的标志物。但本研究样本量相对较少，对于其具体的机制仍有待进一步探索。