模拟体系中谷维素检测方法的建立

赵 晨，孙 聪，梁少华

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

谷维素是植物甾醇和三萜醇的阿魏酸酯混合物[1]，其中环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和β-谷甾醇阿魏酸酯约占谷维素含量95%[2]。谷维素中的阿魏酸酯各组分具有多种生理功能，如抗氧化、调节神经[3]、降低血清胆固醇[4-5]、治疗高血压[6]等。另外，谷维素也可作为食品添加剂改善食品品质[7]。

谷维素的检测方法有许多种，如紫外分光光度法[8]、高效液相色谱法[9]、质谱法[10]等。其中，紫外分光光度法和高效液相色谱氨基柱法[11]能测量谷维素总量，可将谷维素中各组分分离测定的方法主要是高效液相色谱C18柱法[12-13]。高效液相色谱法具有检出限低、灵敏度高、重复性强等优点[14]。由于阿魏酸基团具有紫外吸收特性[15]，所以常采用高效液相色谱-紫外检测法对谷维素进行测定。张连成等[16]利用高效液相色谱C18柱法分析谷维素含量，流动相选择水-乙腈(体积比55∶45)，检测波长为231 nm，发现进样量与峰面积有良好的线性关系。Xu等[17]采用反相高效液相色谱C18柱法，以甲醇-乙腈-乙酸(体积比50∶47∶3)为流动相，在检测波长为330 nm下分离出10种谷维素组分。但这些方法前处理过程均较烦琐，易受到其他物质的干扰。

谷维素在食品加工和日常烹饪中避免不了受到热作用的影响，而不同种类谷维素组分的热稳定性尚不清晰[18-19]。在研究不同种类谷维素组分的热稳定性时，为了减少体系中其他物质的干扰，常需采用干扰较小的模拟体系，如高温下性质稳定的石蜡油-二苯醚(体积比1∶1)混合体系，但目前已有的检测方法分离效果不太理想[20]，影响谷维素各组分的准确定量。因此，作者建立了一种高效液相色谱-紫外检测法对二苯醚-石蜡油(体积比1∶1)模拟体系中谷维素组分进行分离检测，利用外标法对谷维素中4种主要组分进行定量分析，为探究谷维素在模拟体系中的热稳定性提供检测方法，同时为谷维素的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

γ-谷维素纯品(纯度93.1%)：山东汇康食品有限公司；γ-谷维素标准品(环木菠萝烯醇阿魏酸酯23%、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯51%、菜油甾醇阿魏酸酯15%、β-谷甾醇阿魏酸酯10%)：日本Wako公司；二苯醚、乙腈(色谱级)：上海麦克林生化科技有限公司；石蜡油：南昌白云药业有限公司；成品米糠油：盘锦兴旺油脂厂；异丙醇(色谱级)、甲醇(色谱级)：美国VBS有限公司。

1.2 仪器与设备

1525高效液相色谱仪：美国Waters有限公司；DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；XW-80A涡旋振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；BSA224S分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HZT-A2000电子天平：郑州华志科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品溶液的制备

准确称量5 mg谷维素标准品于5 mL容量瓶中，用色谱级异丙醇定容，配制成1 000 μg/mL的标准储备液，分别稀释为500、200、100、50、20 μg/mL谷维素标准品溶液。

1.3.2 样品溶液的制备

将二苯醚和石蜡油按体积比1∶1混匀，称取1 g谷维素纯品并按质量比3%与混合溶剂混合。将混匀后的样品超声处理10 min后，于磁力搅拌器中以转速600 r/min常温下搅拌30 min。分别称取澄清的样品0.1 g、0.5 g、0.75 g于3个25 mL容量瓶中，用色谱级异丙醇定容，制成低(120 μg/mL)、中(600 μg/mL)、高(900 μg/mL)质量浓度的样品溶液，混匀后取适量样品溶液用0.22 μm聚丙烯滤膜过滤，转移至样品瓶中，进行高效液相色谱测定。

1.3.3 高效液相色谱测定条件

色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温40 ℃；等度洗脱流速为0.8 mL/min；流动相为甲醇-乙腈(体积比1∶1)；检测时间50 min；进样量10 μL；紫外检测器波长325 nm。

1.3.4 标准曲线的绘制

取1.3.1不同质量浓度的2 mL谷维素标准品溶液用0.22 μm聚丙烯滤膜过滤，转移至样品瓶中，按照1.3.3 高效液相条件进行测定，每个质量浓度重复测定2次，取平均值。以谷维素各组分质量浓度(x)为横坐标，对应的峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.5 测定方法的考察

1.3.5.1 仪器精密度试验

制备2 mL 446 μg/mL谷维素标准品溶液，经0.22 μm聚丙烯滤膜过滤后转移至样品瓶中，按照1.3.3高效液相色谱条件重复进样6次，记录每次测定的峰面积与保留时间，分别计算峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)。

1.3.5.2 样品重复性试验

按照1.3.2制备待测样品溶液，按照1.3.3 高效液相色谱条件重复进样6次，记录每次测定的峰面积与保留时间，分别计算峰面积和保留时间的RSD。

1.3.5.3 样品稳定性试验

1.3.5.3.1 日内稳定性

按1.3.2方法制成低(120 μg/mL)、中(600 μg/mL)、高(900 μg/mL)质量浓度的样品溶液，分别于2、4、6、8、10、12 h进行测定，计算各样品的峰面积和保留时间的RSD。

1.3.5.3.2 日间稳定性

移取上述1.3.5.3.1的低(120 μg/mL)、中(600 μg/mL)、高(900 μg/mL)质量浓度的样品溶液，分别于第1、2、3、4、5、6天测定样品中谷维素的含量，计算各样品的峰面积和保留时间的RSD。

1.3.5.4 加标回收率试验

准备3组已知谷维素含量的样品，分别加入188.99 μg、274.55 μg、377.99 μg谷维素标准品(各3份)。按照1.3.3色谱条件测定谷维素4种主要组分及总量的含量，计算样品的加标回收率。

1.3.5.5 在米糠油样品中的应用

将已知谷维素含量的成品米糠油样品分为3组，分别加入501.08 μg、1 355.64 μg、2 033.45 μg谷维素标准品(各3份)。按照1.3.3色谱条件测定谷维素4种主要组分含量及总含量，通过计算米糠油样品的加标回收率和RSD对该检测方法进行评价。

2 结果与分析

2.1 谷维素标准品4种组分的线性方程

所用液相条件对于谷维素标准品4种组分具有较好的分离效果，出峰时间从前至后依次为环木菠萝烯醇阿魏酸酯(33.498 min)、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯(36.003 min)、菜油甾醇阿魏酸酯(40.096 min)和β-谷甾醇阿魏酸酯(43.527 min)。表1为谷维素标准品4种组分的线性方程，在20～1 000 μg/mL范围内，4种组分的质量浓度与峰面积存在良好的线性关系。

表1 谷维素标准品4种组分的线性方程

2.2 测定方法的考察

2.2.1 仪器精密度

谷维素标准溶液中4种主要组分的保留时间和峰面积见表2。由表2可见，4种主要组分的保留时间和峰面积的RSD均小于5%，表明该方法所用仪器精密度良好，可靠性高，可用于谷维素的定量分析。

表2 仪器精密度

2.2.2 样品重复性

谷维素样品中4种主要组分的保留时间和峰面积见表3。由表3可以看出，在模拟体系中谷维素4种主要组分的出峰时间和峰面积的RSD都小于5%，表明在该液相条件下，模拟体系中石蜡油和二苯醚对4种主要组分的分离和定量影响较小，谷维素样品进样保持着较好的准确性和较低的误差。

表3 样品重复性

2.2.3 样品稳定性

2.2.3.1 样品日内稳定性

样品日内稳定性结果如表4所示。由表4可知，样品中谷维素4种主要组分的保留时间和峰面积的RSD分别为0.05%～0.26%、0.41%～3.12%，均小于5%。表明在12 h内对样品中谷维素4种主要组分的检测结果较为准确。

表4 日内稳定性

2.2.3.2 样品日间稳定性

样品日间稳定性结果如表5所示。由表5可知，样品中谷维素4种主要组分的保留时间和峰面积的RSD均小于5%。表明在6 d内对样品中谷维素4种主要组分的检测结果较为准确。但当样品质量浓度较高时，环木菠萝烯醇阿魏酸酯峰面积的RSD为4.85%，菜油甾醇阿魏酸酯峰面积的RSD为4.52%，说明放置时间过长会导致环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的峰面积检测准确性降低。主要原因可能是机器误差造成的，也可能是由于放置时间过长，谷维素受到光照或氧化等原因发生降解造成损失，使检测结果误差增大。

表5 日间稳定性

2.2.4 加标回收率

样品加标回收率结果见表6。由表6可知，3组谷维素样品的总量及4种主要组分的加标回收率平均值分别为92.27%～110.87%、83.25%～119.74%，RSD均小于5%，这与朱琳等[21]测定米糠油中谷维素含量结果相近，表明该方法在测定谷维素主要的4种组分时准确性较高，结果较为可靠。

表6 样品加标回收率

2.2.5 在米糠油样品中的应用

为了评估本方法在实际样品中的适用性，采用成品米糠油进行加标回收评价，结果见表7。由表7可知，该方法在检测米糠油样品时总量和各组分加标回收率的RSD均小于5%。表明该检测方法在测定米糠油样品时准确性好，误差小。综上所述，该检测方法在米糠油样品中同样适用，对于米糠油中谷维素总量及各组分含量的测定较为准确，应用在米糠油中与模拟体系有相似的效果。

表7 米糠油加标回收率

3 结论

建立了反相高效液相色谱-紫外检测法测定了模拟体系中谷维素4种主要组分的含量。在谷维素20～1 000 μg/mL范围内，4种组分的线性方程分别为y=34 889x-63 757、y=34 813x-112 228、y=36 565x-67 528、y=35 601x-32 177，R2为0.998 6～0.999 5。该方法中4种组分的检出限为0.15～0.23 μg/mL，定量限为0.49～0.76 μg/mL。在仪器精密度和样品重复性试验中，谷维素4种主要组分保留时间和峰面积的RSD均小于5%，在样品稳定性试验中，谷维素4种主要组分保留时间和峰面积RSD均小于5%。样品总量加标回收率为92.27%～110.87%，谷维素4种主要组分加标回收率为83.25%～119.74%。该方法在检测米糠油样品加标回收率时的RSD均小于5%。综上所述，该检测方法的测定结果准确、灵敏度高、重现性好，可用于模拟体系中谷维素的定量分析。经初步研究，其在米糠油中的应用与模拟体系有相似的效果。