油炸条件对鸡胸肉中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸含量的影响

于小慧，丁 丽，刘 伟*，余晶晶*

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州 450001

油炸为食品原料提供了一个高温加热环境，在此条件下食品组分间发生一系列复杂的化学和物理变化，从而赋予油炸食品诱人的色泽和独特的风味[1-2]，但同时也会产生晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products，AGEs)等有害物质[3]。随着生活质量的提高，人们对优质食品的需求不断增加，消费者不仅仅关注食品的色、香、味，更关注食品的营养、质量和安全，因此食品行业关于AGEs的研究也逐渐开始受到学者的关注。

AGEs是还原糖和氨基化合物的游离氨基之间通过非酶反应产生的一系列复杂化合物[4]。研究表明当人体含有较高水平的AGEs，会增加糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病、肾病、衰老和阿尔茨海默病等多种慢性疾病发病的可能，而饮食是人体AGEs积累的重要来源[5-6]。Uribarri等[7]采用酶联免疫法测定CML并建立了不同食品及其AGEs含量数据库，发现高脂、高蛋白类食品中CML含量较高，高碳水化合物食品中CML含量较少。此外，虽然未经加工的食物原料中也含有AGEs，但热处理可显著提高食品中AGEs的含量。食品中AGEs的形成途径复杂多样，美拉德反应是其主要形成途径[3]：美拉德反应初期，还原糖与氨基化合物发生缩合反应生成席夫碱(Schiff base)，随后席夫碱重排形成相对稳定的Amadori产物；Amadori产物通过脱水、重排一系列反应进一步形成高反应活性的二羰基化合物，如3-脱氧葡萄糖醛酮(3-deoxyglucosone，3-DG)、乙二醛(Glyoxal，GO)、丙酮醛(methylglyoxal，MGO)等；最后，二羰基化合物与游离氨基反应生成结构稳定的AGEs。此外，Amadori产物也可以通过有氧或无氧条件直接形成AGEs。除美拉德反应途径外，脂质过氧化[8](Acetol 途径)、还原糖自氧化[9](Wolff 途径)以及席夫碱氧化裂解[10](Namiki途径)也能生成二羰基化合物，从而进一步形成AGEs。羧甲基赖氨酸(Nε-(carboxymethyl)lysine，CML)和羧乙基赖氨酸(Nε-(carboxyethyl)lysine，CEL)是2种比较典型的AGEs，广泛存在于各种加工食品中，因其含量丰富且存在稳定，常被用做食品中AGEs的标记物[11-12]。

目前关于食品领域中AGEs的研究多集中于模拟体系中AGEs形成机制[13]、食品中AGEs含量的测定和调查[14-15]以及检测方法[16-19]等方面，关于真实食品体系加工过程(如油炸、焙烤)中糖基化终产物的形成机制及影响因素的研究有待进一步完善[20]。因此，探明油炸条件对鸡肉中AGEs形成的影响对掌握真实食品体系中AGEs的含量水平和指导膳食健康具有重要意义。

本研究采用高效液相色谱-质谱联用技术，以鸡胸肉为原料，选择不同的油炸条件对鸡胸肉进行热处理，分析油炸鸡胸肉中CML和CEL含量变化情况，以期揭示油炸条件对AGEs形成的影响，为科学了解CML和CEL在油炸食品中的形成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

冷冻鸡胸肉、高油酸葵花籽油(一级，浸出)、大豆油(一级，浸出)、葵花籽油(一级，压榨)、花生油(一级，压榨)、玉米油(一级，压榨)、菜籽油(三级，压榨)、棕榈油(一级，凝固点23 ℃)均购于郑州当地超市。

1.2 主要试剂

CML、CEL、CML-d4和CEL-d4标准品：加拿大Toronto Research Chemicals公司；乙腈、甲醇和正己烷：HPLC级，美国Dikama公司；醋酸：HPLC级，美国Tedia公司；盐酸、氢氧化钠、硼酸、硼氢化钠：分析纯，国药化学试剂北京有限公司；氨水：分析纯，德国CNW科技公司；其他试剂均为分析纯。CML、CEL、CML-d4、CEL-d4各0.1 mg/mL原液用纯水制备，0 ℃冰箱保存。

1.3 仪器与设备

Fd-1A-50冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司；WeighMax电炸锅:湖北香江电器股份有限公司；TGL-16 M高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；氮气吹气浓缩仪:美国Caliper lifesciences Turbovap II公司；WGL-125B电热鼓风干燥箱:河南泰斯特仪器有限公司；多管涡旋器:德国Talboys公司；Agilent 1200高效液相色谱仪:美国Agilent公司；Triple Quad 4000质谱仪:美国AB Sciex公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备

选取清洗干净、去除表面脂肪和筋膜的鸡胸肉若干，用绞肉机绞碎，称取(10.0±0.2)g肉糜，于直径3 cm、高1 cm模具内制成的肉饼，备用。

1.4.2 油炸试验

将1.0 L的植物油加入恒温油炸锅中，当油温升到预设温度时，将制备好的鸡胸肉油炸一定时间，油炸过程中用温度计实时监测温度变化情况。油炸结束，将油炸鸡肉沥去多余油脂，冷却至室温后置于密封袋中于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.3 鸡肉基本组分的测定

鸡肉中水分、脂肪、蛋白质、灰分含量的测定分别参照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的测定》、GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》、GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》、GB/T 5009.4—2016《食品中灰分的测定》。

1.4.4 样品中CML 和 CEL 含量的测定

参照Yu等[21]的方法并稍做修改。准确称取40 mg粉碎后的样品于50 mL离心管中，用6 mL正己烷脱脂，重复3次。样品脱脂后用氮气吹干，转移到水解管中。加入1.5 mL硼酸钠溶液(0.2 mol/L, pH 9.2)和1～3滴1-辛醇，再逐滴加入1 mL硼氢化钠，4 ℃静置过夜。然后加入2.6 mL 12 mol/L HCl，抽真空通氮气置换3次后密封，将样品在110 ℃下水解24 h。水解后的溶液过滤，滤液加水定容至10 mL。然后取1 mL滤液，加入1 mL水和100 μL内标，混匀后过阳离子交换固相萃取柱。阳离子交换固相萃取柱依次用2 mL甲醇和0.1 mol/L盐酸溶液活化后上样，再用2 mL水洗涤，最后用5 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮气吹干，1 mL水复溶，过0.22 μm水相滤膜，滤液置于色谱瓶中，进行HPLC-MS/MS分析。

液相色谱条件如下。仪器为Agilent 1200；色谱柱: Agilent Proshell 120 SB C18柱(3.0 mm×150 mm, 2.7 μm)；柱温35 ℃；流速 0.3 mL/min；进样量 10 μL；流动相 A 为 0.3%乙酸水溶液，B 为 0.3%醋酸-乙腈溶液，梯度洗脱条件：0～5.0 min，100% A～80% A；5.1～10.0 min，80% A～10% A；10.1～15 min，100% A。

质谱条件如下。电离方式：正离子模式(ESI+)；扫描方式：多反应监测(MRM)，参数如表1所示；离子喷雾电压5.0 kV；离子源温度550 ℃；气帘气氮气，30 psi；雾化气70 psi，辅助气，70 psi。

表1 HPLC-MS 多反应监测模式(MRM)参数

1.5 数据处理

每组试验进行3次重复，数据均以平均值±标准偏差表示；SPSS 19软件进行统计分析；Analyst Software 用于AGEs数据分析；Origin 2021用于绘制图表。

2 结果与分析

2.1 原料基本组分及CML和CEL含量

鸡胸肉的基本组分含量如表2所示，水分含量为72.43%，蛋白含量为21.78%，脂肪含量为2.36%，灰分含量为1.52%。为了解油炸对鸡胸肉中AGEs含量的影响，对原料鸡胸肉中CML、CEL含量进行了测定，发现未经加工的鸡胸肉中CML、CEL含量分别为(144.50±14.14)mg/kg、(9.38±0.14)mg/kg，AGEs含量较低。Zhu等[22]在未经煎炸的鸡胸肉中也检测到较低含量的CML和CEL。这可能是因为在高蛋白、高脂肪的肉类体系中，美拉德反应和脂质氧化在常温条件下缓慢进行，从而导致生肉中能够积累少量的AGEs。

表2 原料基本组分及CML和CEL含量

2.2 植物油种类对油炸鸡胸肉中CML和CEL含量的影响

在油炸温度为180 ℃、油炸时间为5 min条件下，研究了大豆油、花生油、玉米油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、棕榈油、菜籽油7种植物油脂对油炸鸡胸肉中CML和CEL含量的影响。由图1可以看出，经不同种类的油脂在180 ℃条件下油炸5 min的鸡胸肉中CML含量为218.40～311.20 mg/kg，CEL含量为43.38～64.00 mg/kg，油炸加工显著增加了鸡胸肉中CML和CEL含量。不同种类的植物油脂油炸鸡胸肉中CML存在较大差异，采用不同油脂油炸的鸡胸肉中CML含量的由高到低：大豆油>花生油>玉米油≈葵花籽油>棕榈油>菜籽油>高油酸葵花籽油，高油酸葵花籽油和菜籽油油炸鸡胸肉中CML含量较低，分别为218.40、226.40 mg/kg，显著低于其他5种油脂(P<0.05)。对于CEL而言，棕榈油油炸鸡胸肉中CEL含量较高，为64.00 mg/kg，但整体而言，不同植物油油炸鸡胸肉中CEL含量差异不明显(P>0.05)。高油酸葵花籽油油酸含量大约为85%，多不饱和脂肪酸含量相对较低，较传统植物油而言具有较高的氧化稳定性；菜籽油为三级成品油，可能含有较高含量的天然抗氧化物质，在热加工过程中可以在一定程度上抑制脂质氧化。脂质氧化是形成AGEs中间物质的一个重要途径，因此高油酸葵花籽油和菜籽油油炸鸡胸肉中AGEs含量较低的原因可能是，二者在热加工过程中脂质氧化程度较其他几种植物油低。由此可见，在油炸食品过程中选用合适的油脂对控制食品中的AGEs具有重要意义。大豆油作为一种大宗油料，价格较低，在我国食用油中年消费量最大[23]，日常生活中使用广泛，因此选用大豆油作为煎炸油进行后续研究。

2.3 油炸温度对油炸鸡胸肉中CML和CEL含量的影响

温度是影响糖基化终产物形成的一个关键因素。以大豆油炸鸡胸肉，设定油炸时间为5 min，研究不同温度对油炸鸡胸肉中CML和CEL含量的影响。由图2可以看出，在140～220 ℃范围内，随着温度的增加CML、CEL含量不断增加，温度越高，样品中CML、CEL含量越高、生成速率越快。在220 ℃条件下油炸5 min的鸡胸肉中CML、CEL的生成速率分别为34.62、49.47 mg/kg·min-1，分别为140 ℃条件下的2.53倍、19.02倍；在140～180 ℃范围内，CML的增长速率显著高于CEL，而在180～200 ℃之间，CML增长缓慢，CEL含量急剧增长，CML和CEL的含量增长速率存在显著差异，这可能是与CML和CEL的生成途径不同有关。吴帅[24]研究了鸡蛋蛋白在热加工过程中CML和CEL的生成规律，发现二者生成的活化能分别为100.89 kJ/mol和122.39 kJ/mol，表明CEL比CML较难生成，因此较低温度(140～180 ℃)条件下CEL的生成速率要小于CML。因此，在140～220 ℃油炸温度范围内，温度越高，油炸鸡胸肉中CML和CEL含量越高，油炸时在保证食物营养、风味、色泽和生产效率的同时，要尽可能选择较低的油炸温度。

2.4 油炸时间对鸡胸肉中CML和CEL含量的影响

在180 ℃条件下，采用大豆油对鸡胸肉进行油炸，研究不同油炸时间对鸡胸肉中CML和CEL含量的影响，结果如图3所示。在相同温度条件下，0～11 min随着油炸时间的延长，鸡胸肉中CML和CEL含量不断增加。其中CML含量从初始含量144.50 mg/kg增长至347.50 mg/kg，约为生肉中的2.40倍；CEL从9.38 mg/kg增加到93.25 mg/kg，增加了8.94倍；油炸时间越长，鸡胸肉中CML和CEL 含量水平越高。0～3 min食品体系内反应底物充足，CML、CEL快速大量积累；继续延长油炸时间，食品中反应底物逐渐被消耗，导致CML和CEL含量增长速率有所下降。在180 ℃油炸条件下，相较于CEL，鸡胸肉中CML更容易在较短时间内得到大量积累。油炸时间为7、9、11 min时，油炸鸡胸肉中CML含量分别为332.50、336.38、347.50 mg/kg，较为相近。由此可见，在一定范围内油炸时间对鸡胸肉中CML含量影响并不显著，可以采取在较低温度条件下通过适当延长油炸时间保障食品风味及色泽的同时降低AGEs含量。

2.5 油炸次数对鸡胸肉中CML和CEL含量的影响

通常在制作油炸食品时，植物油会反复加热使用。Chhabra等[25]曾报道，经多次重复加热使用的油脂其油炸样品中荧光性AGEs含量要高于新鲜油脂的油炸样品。如图4所示，在180 ℃、5 min油炸条件下，研究了大豆油的油炸次数对鸡胸肉中CML和CEL含量的影响。总体而言，随着大豆油反复使用次数的增加，CEL含量变化不明显，CML含量有所下降。这可能是因为随着油脂不断进行加热和反复油炸食物时，油脂发生氧化降解，生成的中间体物质GO、MGO进入食物体系内参与CML和CEL的形成而不断被消耗，导致食品体系内参与CML和CEL反应的GO、MGO含量下降，从而导致其含量降低。此外，油炸次数相近的鸡胸肉样品中，CML、CEL含量相差不大，表明在相对较短时间内油脂重复使用并不足以引起AGEs含量发生显著变化。

2.6 油脂连续加热时间对鸡胸肉中CML和CEL含量的影响

为进一步了解油脂在油炸过程中对鸡胸肉中AGEs含量的影响，选用大豆油，在180 ℃、5 min的油炸条件下，研究了油脂连续加热时间对鸡胸肉中CML和CEL含量的影响。将油温升至180 ℃的时间点记为0 h，在0～12 h内取点对鸡胸肉进行油炸，鸡胸肉中CML、CEL含量变化情况如图5所示。0 h时，油炸鸡胸肉中CML含量为325.00 mg/kg，CEL含量为51.63 mg/kg；当大豆油在180 ℃条件下连续加热12 h后，样品中CML含量为252.50 mg/kg，CEL含量为39.125 mg/kg；随着油脂连续加热时间的延长，鸡胸肉中CML和CEL含量有所下降。这可能是因为油脂连续加热过程前期，进入到食品体系的油脂在高温条件下氧化形成CML和CEL的中间体物质GO和MGO，参与并促进了CML和CEL的形成。当油脂在较高温度下加热较长时间后，一方面中间体物质GO、MGO不断被消耗，导致参与形成CML和CEL的量降低；另一方面油脂在高温条件下发生氧化和水解反应，产生游离脂肪酸和部分小分子酸性物质，而Kong等[26]的研究表明酸性增强可延缓体系中AGEs的形成。所以随着油脂连续加热时间的不断延长，油炸鸡胸肉中CML和CEL含量有所下降。

3 结论

研究了不同油炸条件对鸡胸肉中CML和CEL含量的影响，结果表明：生肉中CML和CEL的含量分别为144.50 mg/kg和9.38 mg/kg，采用不同植物油在180 ℃条件下油炸5 min的鸡胸肉中CML含量为218.40～311.20 mg/kg，CEL含量为43.38～64.00 mg/kg，油炸加工显著增加了鸡胸肉中CML和CEL含量。不同种类的植物油脂油炸鸡胸肉中CML存在较大差异，高油酸葵花籽油和菜籽油油炸鸡胸肉中CML含量较低，分别为218.40、226.40 mg/kg，显著低于其他5种油脂，对于CEL而言，油脂种类对其含量的影响不明显；CML和CEL含量随油炸温度的升高和油炸时间的延长呈不断增加趋势，温度越高，CML和CEL的生成速率越快，在220 ℃条件下油炸5 min的鸡胸肉中CML和CEL的生成速率分别为34.62、49.47 mg/kg·min-1，分别为140 ℃条件下油炸鸡胸肉的2.53倍和19.02倍；随油炸次数的增加，CML含量略有下降，CEL含量整体变化不明显；随油脂连续加热时间的延长，油炸鸡胸肉中CML和CEL的含量略有下降，CML和CEL的含量均在初始时间油炸时取得最大值，分别为325.00、51.63 mg/kg。因此，在对食品进行油炸加工时，可以通过优化油炸条件调控油炸食品中AGEs的含量，本研究对指导油炸食品中风险因子的防控有一定参考意义。