丙酸钠对阿尔茨海默病小鼠炎症因子表达的影响

郎文萱，李晓辰，王艺颖，段云涛，王 钰，魏鹏晟，李 雪，崔 跃，朱启文*

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是痴呆症最常见的病因，导致记忆、行为和认知功能逐渐丧失。AD增长迅速，预测到2050年我国患病人数将达到2 687万[1]。尽管经过几十年的研究和药物开发，仍然没有治愈AD的方法，甚至没有可行的长期治疗方案[2]。

神经炎症是AD的一种重要机制。Aβ的沉积会激活小胶质细胞产生更多的促炎因子[3]，随着炎症反应的发展，小胶质细胞释放的促炎因子加剧了脑环境恶化[4]。研究表明，抑制神经炎症可以保护神经元，减轻学习记忆障碍。短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)是肠道微生物菌群的代谢产物，包括乙酸、丙酸、丁酸等[5]。SCFAs可以促进肠道内稳态，抑制肠道炎症[6-7]。SCFAs在发挥抗炎作用的同时，能够通过抑制自由基，减少炎症级联引起的细胞氧化应激，消除潜在的损伤产物。其中丙酸钠(Sodium propionate，SP)是SCFAs的一种，由于其具有抑制组蛋白去乙酰化酶的能力，对炎症有影响。已有文献报道，SP对Aβ1-42诱导的神经毒性和脊髓损伤具有保护作用[8]。而且SP可能通过抑制某些信号分子达到抗炎和抗凋亡的作用。

本研究采用Aβ1-42诱导的AD小鼠模型，探讨SP对AD小鼠认知功能和炎症因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用SPF级成年ICR小鼠60只，体重(30±5)g，购自辽宁省沈阳市长生生物有限公司，所有程序均按照中国动物福利法和沈阳医学院动物伦理委员会的准则进行。造模前适应性饲养1周，之后按照随机原则进行分组，动物房温度：18～22 ℃，湿度：50%～60%，灯光照射时间12 h明12 h暗交替进行，动物可自由进食饮水。

1.2 动物造模 麻醉：将小鼠用异氟烷进行吸入麻醉，麻醉成功后进行备皮及侧脑室注射，将小鼠头部消毒剃毛后，沿小鼠头部皮肤矢状线切开1 cm左右的切口，暴露小鼠颅骨前囟点，根据《小鼠脑立体定位图谱》确定注射位置，侧脑室注射Aβ1-42(Abcam,Cambridge,UK,ab120959)。术后处理：用可吸收手术缝合线进行切口缝合后，再用红霉素涂抹伤口，最后肌注青霉素3 d预防感染。

1.3 动物分组及给药[9-10]将ICR小鼠随机分为5组，分别为假手术组、Aβ1-42组、Aβ1-42+SP 50 mg/kg组、Aβ1-42+SP 100 mg/kg组、Aβ1-42+SP 200 mg/kg组，每组12只。在侧脑室注射Aβ1-42后1 d进行SP(Sigma公司，p1880)腹腔给药。给药分为低、中、高剂量，分别为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。假手术组和Aβ1-42组给予生理盐水，连续21 d后取材。

1.4 实验方法

1.4.1 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫主要由白色圆形水池(直径120 cm,高45 cm)、可移动的黑色平台和视频跟踪系统组成。实验过程中水温保持在(25±1)℃。实验过程分为定位巡航和空间探索两部分。定位巡航阶段为连续5 d，每天进行2次实验。小鼠可以成功地找到平台，并且在平台上停留10 s。如果小鼠在60 s内找不到平台，需要人为引导到达平台并站立10 s，以小鼠找到平台所用的时间作为学习能力的指标。每只小鼠落在平台上的时间被记录为逃避潜伏期。第6天对小鼠进行记忆能力检测，即空间探索阶段，将隐藏平台撤掉，将小鼠放置在水池中。记录在1 min内小鼠穿越平台次数等。

1.4.2 酶联免疫吸附实验(ELISA) 使用酶联免疫吸附实验试剂盒(伊莱瑞特生物科技股份有限公司，武汉，中国)测定额叶皮质中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-10(IL-10)的水平。预先将ELISA试剂盒从4 ℃冰箱取出，置于室温环境，室温平衡20 min后，取出试剂盒按照说明书进行后续实验。根据OD值用Orgin软件计算出蛋白浓度。

2 结果

2.1 水迷宫结果 采用Morris水迷宫试验评价小鼠的空间学习和记忆能力。在第5天的定位巡航阶段，与假手术组相比，Aβ1-42组小鼠寻找平台的时间更长(P<0.001)，与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+SP 100 mg/kg组和Aβ1-42+SP 200 mg/kg组均显著降低了逃避潜伏期(P<0.001),而与Aβ1-42+SP 50 mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

在空间探测阶段，与假手术组相比，Aβ1-42组小鼠穿越平台次数较少(P<0.001)，与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+SP 100 mg/kg组和Aβ1-42+SP 200 mg/kg组穿越平台次数均增加(P<0.05,P<0.001)。而Aβ1-42+SP 50 mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05)。水迷宫结果显示，阿尔茨海默病小鼠造模成功，并且丙酸钠改善了Aβ诱导的AD小鼠的认知能力，见表1。

表1 各组小鼠第5天逃避潜伏期时间和第6天穿越平台次数

2.2 IL-1β和TNF-α结果 采用鼠源IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒，以空白孔调零检测其450 nm处的OD值测量表达量。IL-1β结果显示，与假手术组相比，IL-1β表达水平在Aβ1-42组增加(P<0.001)，与Aβ1-42组相比，IL-1β表达水平在Aβ1-42+SP 100 mg/kg组和Aβ1-42+SP 200 mg/kg组减少(P<0.01，P<0.001)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

TNF-α结果显示，与假手术相比，TNF-α表达水平在Aβ1-42组增加(P<0.05)，与Aβ1-42组相比，TNF-α表达水平在Aβ1-42+SP 200 mg/kg组表达减少(P<0.05)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg组和Aβ1-42+SP 100 mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 IL-4和IL-10的结果 采用鼠源IL-4和IL-10 ELISA试剂盒，以空白孔调零检测其450 nm处的OD值测量表达量。IL-4结果显示，与假手术组相比，IL-4表达水平在Aβ1-42组减少(P<0.01)，与Aβ1-42组相比，IL-4表达水平在Aβ1-42+SP 200 mg/kg组表达增加(P<0.05)，而在Aβ1-42+SP50 mg/kg和Aβ1-42+SP 100 mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

与假手术组相比，IL-10表达水平在Aβ1-42组减少(P<0.001)，与Aβ1-42组相比，IL-10表达水平在Aβ1-42+SP 100 mg/kg组和Aβ1-42+SP200 mg/kg组表达增加(P<0.01，P<0.001)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg组差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组小鼠IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10表达水平比较

3 讨论

AD的主要病理特征之一是由大量Aβ沉积形成的老年斑。Aβ可引起氧化应激、神经炎症、能量代谢紊乱和离子紊乱等，最终导致退行性病变和神经元丢失[11-12]。

本研究探讨了丙酸钠对AD病理进展中神经炎症反应的影响。结果显示，与假手术组相比，Aβ1-42组IL-1β和TNF-α的含量明显上升，与Aβ1-42组相比，丙酸钠中剂量组IL-1β的含量下调，高剂量组IL-1β和TNF-α的含量显著下调。说明丙酸钠对促炎因子有明显的调节作用。另外，本研究也探讨了丙酸钠对抗炎因子的作用，与假手术组相比，Aβ1-42组IL-4和IL-10的含量明显减少，与Aβ1-42组相比，丙酸钠中剂量组IL-10的含量显著上调，丙酸钠高剂量组IL-4和IL-10的含量上调。先前的研究表明，小胶质细胞是中枢神经系统的先天免疫效应细胞，具有维持大脑稳态的作用。在AD大脑中，活化的小胶质细胞伴随着促炎细胞因子的增加，如白细胞介素和TNF-α[13-14]。Aβ的积聚可以导致炎症反应。Aβ激活小胶质细胞，并与受体CD14、CD36和CD47结合。这种相互作用使小胶质细胞分泌更多的促炎介质[15]。有研究显示，丁酸钠可抑制小胶质细胞的激活，减少神经炎症的发生和Aβ的积聚[16]。丙酸钠在体外神经炎症模型和体内脊髓损伤模型中，可减少炎症过程，具有神经保护作用。正常衰老细胞与抗炎因子IL-4和IL-10降低有关，IL-10通过抑制促炎细胞因子受体表达和激活来减少促炎细胞因子的产生[17]，因此，IL-10的减少可能导致促炎细胞因子表达延长和增加，使衰老的大脑容易受到伤害。本研究支持丙酸钠可通过降低促炎因子的表达，提高抗炎因子的表达，进而减少AD小鼠的神经炎症反应，有效改善了小鼠的认知功能。

综上所述，在Aβ1-42诱导的AD小鼠动物模型上，本研究提供了丙酸钠具有治疗潜力的实验证据。丙酸钠通过减少促炎因子IL-1β和TNF-α的表达，提高抗炎因子IL-4和IL-10的表达，改善AD小鼠的认知能力。丙酸钠调控AD模型中促炎因子和抗炎因子平衡的具体机制有待进一步研究。