WHO—ECAMM标准在疟原虫感染效能检测中的应用研究

王小梅 梁志超 杜 丹 任海林 李 旭 张代涛 何战英

(北京市疾病预防控制中心，北京市预防医学研究中心，北京 100013)

疟疾(malaria)是由疟原虫Plasmodiumspp.所致的蚊媒传染病，是全球最严重的公共卫生问题之一。2018年，全世界估计发生2.28亿疟疾病例(WHO, 2019)。近年来，全球消除疟疾的范围正在扩大，越来越多国家接近本土病例为零。本土病例少于100的国家数量从2010年的17个增加到2017年的25个和2018年的27个；表明，全球消除疟疾已胜利在望。2010年我国提出“全国疟疾消除计划”，总目标为到2015年除云南边境地区外，其他地区无疟疾当地病例传播；到2020年全国范围内实现消除目标，即连续3年无本土感染病例传播。2017年，我国首次实现本地病例零报告(丰俊，2019；张丽，2019)。

北京市属于消除计划中的四类地域，需及时做好输入病例的处置工作。快速、准确的诊断是有效防治疟疾的关键因素，为此，国家疾控管理部门有计划地从各省市抽调工作人员参加WHO—ECAMM(WHO External Competency Assessment for Malaria Microscopists)培训及考核。尽管多种检测方法发展迅速，厚、薄血膜涂片镜检法仍然是疟疾检测的“金标准”，但原虫形态多变，影响因素较多，对镜检人员的要求较高。2011—2017年，本实验室主要以实时荧光定量PCR、巢式PCR和镜检3种方法同时进行样本复核检测，间或以RDT作为辅助，实际工作中发现镜检阳性率最高，巢式PCR阳性率高于实时荧光PCR，但差距不大，与镜检相比均有“假阴性”情况出现，RDT阳性率相对最低，与国内同行结论有所不同(营亚茹，2014；王真瑜，2017)。因此，本文选取2018—2019年全部样本，从血片制作到镜检严格按照我国现行诊断标准，并参照WHO—ECAMM标准进行，与实时荧光定量PCR法进行检测效能比较，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 WHO—ECAMM考核评估

WHO—ECAMM总计考核56张血片，考核血片全部来源于WHO，考官由WHO官员担任(Li, 2019)。每张血片计时10 min，结果判定包括原虫识别、虫种鉴定及原虫计数3部分。原虫识别和虫种鉴定计42张血片，结果判定为：阴性、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵型疟原虫、三日疟原虫、混合感染(明确写出原虫型别，错误不得分，漏写扣一半分)。原虫计数为指定14张恶性疟血片，密度计算公式为：(原虫数/白细胞数)×8 000个/μL。密度计数考核范围从<100至200 000～400 000个/μL。测评标准：原虫识别(阴阳性判定)准确率不低于90%(42张血片错误小于4张血片)，原虫型别鉴定准确率不低于90%(42张血片错误小于4张血片)，原虫计数准确率不低于50%(计数<标准参考值75%或>125%不得分，计数错误<7张血片)，可以获得WHO—ECAMM 一级证书，证书有效时限3年。

1.2 资料来源

收集2018—2019年北京市各区疾控中心送检的临床诊断或疑似疟疾病例的抗凝血，共计227件。

1.3 镜检

血涂片的制作和疟原虫镜检方法参照《WS 259—2015 疟疾诊断标准》《疟原虫检测 血涂片镜检法 WS/T 569—2017》(中华人民共共和国国家卫生和计划生育委员会，2015, 2017)。血涂片制作符合国家标准，厚、薄血膜的形状、大小、染色参照WHO—ECAMM考核用血片库提供的血片样式，国家标准和WHO血片库标准一致。镜检以检查厚血膜为主，薄血膜用于虫种鉴别辅助，根据虫体不同发育时期不同形态特征进行虫种鉴定。10 min内或200视野以上，厚血膜未见疟原虫可判为阴性。由WHO—ECAMM一级镜检员在100倍油镜下进行，同时进行原虫计数。单一样本从血涂片制作到镜检完成耗时30 min，其中，镜检在10 min内完成。

1.4 疟原虫核酸检测

采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取待检测核酸，采用上海之江公司恶性疟/间日疟/三日疟/卵型疟疟原虫核酸检测试剂盒进行荧光定量PCR检测。反应总体积为40 μL，PCR扩增参数：37 ℃ 2 min, 94 ℃ 2 min, 93 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 循环40次，60 ℃进行荧光信号收集。依试剂盒说明书，Ct≤38可判为阳性。当待检测样本中核酸浓度含量低于最低检测限103copies/mL时，可能发生假阴性结果。因PCR技术发展迅速，每种的敏感性不尽相同(鲁少平，2015；李轲，2013；李美，2015)，本文选用实验室常用的一种成品试剂盒作为定性比较，核酸检测由实验室内具备分子生物学检验技术资质的人员承担。

1.5 统计分析

疟原虫显微镜检与核酸检测的计数资料差异采用χ2检验和一致性分析方法。一致性检验分析(李立明，2015)，数理统计的原理及公式如下：特异度(即真阴性度)=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%，阳性预告值=真阳性/(真阳性+假阳性)×100%，阴性预告值=真阴性/(假阴性+真阴性)×100%。

2 结果

2.1 镜检及荧光定量PCR的检测结果

收集的227件样本，镜检结果为：恶性疟129件、间日疟12件、三日疟9件、卵型疟17件、混合感染10件、阴性50件；实时荧光定量PCR检测结果为：恶性疟110件、间日疟6件、三日疟7件、卵型疟12件、混合感染6件、阴性86件。两种疟疾检测方法效果比较，详见表1。

表1 两种方法检验疟原虫效果比较

两种方法检测同一份样品，都取得了较高阳性率，总体阳性率在70%左右。但显微镜检高于实时荧光定量PCR，P<0.005，其差异有非常显著性统计学意义。可以看出，获得WHO—ECAMM资质的显微镜检的灵敏性更优越。在不同型别疟原虫检出效果上，亦显示出同样趋势，特别是对于间日疟和混合疟，显微镜检的辨识力更强。

2.2 两种检测方法一致性分析

按照显微镜检和实时荧光定量PCR均阳性、显微镜检阳性而实时荧光PCR阴性、显微镜检阴性而实时荧光PCR阳性、显微镜检和实时荧光PCR均阴性4种状态列表(表2)。

表2 两种检测方法一致性分析

显微镜检和实时荧光定量PCR一致性为84.1%，实时荧光定量PCR灵敏度为79.7%，假阴性为20.3%。特异度和阳性预告值均为100%，阴性预告值为58.1%。显微镜检和实时荧光定量PCR诊断疟原虫感染，一致性达到88.1%，相互验证了两种方法的可靠性和准确性，都是检测疟原虫感染的优选技术，都可以作为诊断疟疾“金标准”。和显微镜检相比，实时荧光定量PCR检测疟原虫感染灵敏度为79.7%，虽也灵敏，但有差距，其特异度和阴、阳性预告值达到100%，诊断疟原虫感染极少出现假阳性，但阴性预告值为58.1%，即实时荧光PCR判断为阴性，其真正阴性的几率为58.1%。表明在疟原虫感染状态中，实时荧光PCR报告阴性，未必是真的阴性，经计算假阴性率为20.3%，不可忽视。经此比较后，显微镜检诊断疟原虫感染，效能确实精准高效，金标准地位牢靠。

3 讨论

北京市疟疾防控情况特殊，90%左右的样本来源于三家综合性传染病医院，其余样本多来源于大型综合性医院。输入性疟疾与境外多种烈性传染病具有相同的疫源地，如基孔肯雅热、黄热病、埃博拉等(孙玉兰等，2020)，在疫情处理过程中，快速明确诊断尤为关键。

显微镜检是最为经典的疟原虫病原学检测方法，快捷且廉价。血片涂制在3～5 min内可以完成，待厚血膜完全干燥后染色10 min，自然晾干后即可进行镜检。受空气湿度影响，厚血膜干燥的时间略有不同。经过训练的镜检人员可在10 min内做出明确判断，准确率可大于90%。显微镜检从样本制作到明确判断结果，检测全程可在30 min内完成。能够更有效地节约时间、人力、物力、财力。同时，疟疾(特别是恶性疟)病情发展迅速，诊断越快，越能降低感染者的危险。

实时荧光定量PCR是一种相对省时的分子生物学方法。疟原虫核酸提取可以有多种方法，最快可在30 min内完成。不同试剂盒的实时荧光PCR所需时间也有差距，本文所选试剂可在90 min内完成。检测全程最少需要2 h。巢式PCR以及基因测序等更为精准的实验室检测方法，用时则更长。

WHO—ECAMM考核是对镜检人员的综合评定，从精力、心理、能力全方位考核，充分考虑多种影响因素，最大限度的保持公正公平客观。经过WHO—ECAMM认证，镜检员技术水平稳定提高(Li，2019)。本文结果显示，在平行样品检测中，显微镜检测敏感性高于实时荧光定量PCR，展示了优秀效能。在恶性疟、间日疟、三日疟、卵型疟、混合感染的型别鉴定中，一致性亦优于实时荧光定量PCR。科学地印证了显微镜检和实时荧光定量PCR总体一致性达到84.1%，都是检测疟疾感染的先进手段。

巢式PCR检测疟原虫灵敏度可达10个/μL以下(李轲，2013)，更高者可达1个/μL(Han，2007)。实时荧光定量PCR、巢式PCR等分子生物学技术在医药卫生领域和其他生物技术领域发挥了不可替代的功用(冯霞，2020；王爱梅，2020)，技术成熟，经过培训的工作人员可掌握基本技能且重复性好(张耀光，2021)。在疟疾感染的PCR检测中，由于受不同厂家、试剂、生产批次、特异基因片段的影响(李轲，2013；李美，2015)，灵敏度和稳定性也受到一定影响。本文仅比较了一种实时荧光定量PCR成品试剂和显微镜检的检测效能，表明镜检人员通过严格长期培训后，可达到快速准确诊断疟疾的目的。但由于人员差异明显，实验的可重复性和稳定性达不到PCR的水准。应对更多新的传染病疫情和突发公共卫生事件，PCR有较多的应用场景和提升空间。

在227件样本的检测过程中，由于样本采集时间的不同，原虫形态受药物、采集时间、送检时间、检测时间影响很大，较WHO—ECAMM提供的考核血片更为复杂，需要不断积累大量经验才能做出准确判断。在操作实践中，部分样本采集时间可能在病人已经服药之后，血中原虫很有可能已经降至很低水平甚至消失，恶性疟患者配子体少见或偶见其他时期形态，都严重影响镜检结果，而送检时间延误，有可能导致的血样溶血，也会使镜检判别非常困难(王小梅，2021)而对于混合感染的样本，即使两种疟原虫存在同一病例体内，也会有感染密度不同的情况出现，(李仁清，2019)。在国内报道中，曾有卵型疟不同亚型的出现，依据不同引物的PCR结果可以判断亚型的具体型别(李美，2014)。而对于卵型疟的不同亚型，形态学并无差别，镜检无法第一时间进行评判。

经多年的防控，北京市各种寄生虫疾病的感染率大幅下降，医务人员对于寄生虫病的重视程度也随之下降，大型医疗机构人员岗位流动性大，从事镜检的专职人员少，技术储备不足日益凸显。服药后或者密度极低感染者样本的出现，给检测增加了难度。快速确诊成为输入性传染病防控的最基本要求。在引进新技术的同时，也要重视培训医务人员的实验技能和操作水平；镜检除高效检出疟原虫外，还能够评判用药效果。

当下，中国本土无疟疾病例报告，输入性疟疾却不断攀升。随着全球化和旅游、物流频繁猛进，多种传染病的境外输入日益增多(李夫，2020)，疟疾的输入已经成为常态。如何更高效准确的进行疟疾诊断，与多种传染病进行快速鉴别诊断，是当前传染病防控工作的应有之义。

综上所述，以镜检为主的多种疟疾检测方法联合应用，能够更好地服务于北京市疟疾防控工作。