环境水体中血吸虫尾蚴检测技术的应用研究进展*

梁 莎 曾凡胜 秦志强

(1.益阳医学高等专科学校，益阳市洞庭湖区血吸虫与病原生物控制技术重点实验室，湖南益阳 413000；2.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心); 国家卫生健康委寄生虫病原与媒介生物学重点实验室; 世界卫生组织热带病合作中心; 科技部国家级热带病国际联合研究中心, 上海 200025)

血吸虫病是一种严重危害人民群众身体健康、影响社会经济发展的人兽共患寄生虫病，目前主要流行于非洲、亚洲、南美洲和中东等78个国家和地区，属于全球性的公共卫生问题(Zhouetal.，2021)。我国流行的血吸虫种是日本血吸虫Schistosomajaponicum，主要分布在南方长江流域的12个省、自治区和直辖市(曹淳力等，2019)。全国血吸虫病疫情总体保持持续下降态势，但血吸虫病传播风险因素依然存在(洪志华，2018；许静等，2018；钟波等，2019)，部分省份人群血检阳性率仍处于较高水平；突出问题主要包括有螺面积分布广、控制困难(高风华等，2018；张利娟等，2019)；动物传染源控制成果巩固困难；输入病例问题凸显，部分地区疫情被低估、人群感染风险较高等情况。2020年底全国450个流行县(市、区)疫情数据分析显示，我国血吸虫病整体呈低度流行水平，如期实现《“十三五”全国血吸虫病防治规划》目标，但局部地区疫情仍有反弹，其中新发现有螺面积1 174.67 hm2，感染性钉螺面积1.96 hm2，因此，仍需强化血吸虫病疫情及风险监测，持续开展精准防控、在巩固已有防治成果的基础上稳步推进血吸虫病消除工作(张利娟等，2021)。环境水体中尾蚴的检测一直是血吸虫病监测预警的重要内容之一，多年来国内外学者围绕血吸虫尾蚴的富集、快速识别、定性与定量检测方法开展了大量研究。本文就以血吸虫尾蚴的富集与检测技术研究进展进行综述，以促进血吸虫病消除工作的顺利推进。依据尾蚴不同的生物生态学特性，国内外学者开发了适用于环境水体中尾蚴的检测技术(党辉等，2020)。环境水体中血吸虫尾蚴的检测方法主要有两大类：一类是环境水体中尾蚴的采集与检测，另一类是环境水体中尾蚴的实时监测。

1 环境水体中尾蚴的采集和检测

1.1 尾蚴的采集方法

血吸虫尾蚴的体积较小，一般较难直接捡获水中的尾蚴，因此环境水体中尾蚴需要浓缩采集后再进行检测以提高捡获率。目前国内外的尾蚴采集方法主要有哨鼠法、C-6膜法、仿生动物皮膜法、富集法、粘取法和网捞法等(表1)。

表1 尾蚴采集方法对比

1.1.1哨鼠法：哨鼠法即哨鼠捡获法：是将哨鼠暴露于疫水环境中一定时间，将可能感染尾蚴的哨鼠室温养5～6周，然后解剖哨鼠观察其感染血吸虫的状况，此方法是目前广泛应用的疫水中尾蚴监测方法(向瑞灯等，2016；神学慧等，2017；徐国余等，2018)。为进一步提高哨鼠在不同环境疫水测定中的准确性和灵敏度，吴锋等(2015)对投鼠笼进行了改进，使漂浮式鼠笼能随水位自由升降，哨鼠死亡数明显减少，回收率可达到97.44%。

1.1.2C-6膜法：C-6膜法属于尾蚴粘捞法，C-6膜是一种无色、无嗅、无毒、通过静电效应吸附尾蚴的薄膜材料(刘榆华等，1997)。此法利用日本血吸虫尾蚴漂浮的生物特性，对水面的尾蚴进行采集。蔡士椿等(1994)在此基础之上建立了C-6膜小面积多点抽样检测技术：将C-6膜固定在载具上、浮于水面粘取尾蚴，带回实验室镜检，获蚴率最高可达40%，高于尼龙绢材质粘取沉淀法20倍。本法操作简便快捷，当天可有检测结果，费用仅为哨鼠法的1%；粘取的尾蚴形态完整，完整率与尾叉清晰率均高达95%，利于广泛应用。

1.1.3仿生动物皮膜法：仿生动物皮膜是利用猪皮等动物的皮为主要原材料，将猪皮匀浆、水、明胶和苯甲酸钠按40∶60∶3∶50的比例混合制成厚约0.1 cm的膜，即仿生动物皮膜。设置哨鼠组作对照，结果发现，仿生动物皮膜法比哨鼠检测法的检出率更高(彭国华等，2018)。彭国华等(2020)的实验结果显示，添加与未添加苯甲酸钠动物皮膜获取尾蚴效果一致。考虑到苯甲酸钠具有防腐剂作用，便于动物皮膜长时间保存，因此推荐含有苯甲酸钠的仿生膜连续使用。

1.1.4尾蚴富集法：为克服环境水体中尾蚴密度低、环境水体情况复杂等不利因素，利用过滤原理设计机械富集装置采集尾蚴，以提高环境水体中尾蚴捡获率。1982年英国Kloos(Kloos，1982)根据埃及血吸虫S.haematobium尾蚴逸出后混悬于水体特点，在实验室中利用30 μm孔径的过滤器过滤一定体积福尔马林处理过的含埃及血吸虫尾蚴水体，结果发现5 L水回收率为51%，10～20 L水回收率达到19%～30%。波多黎各传染病研究中心(Klock，1961)利用曼氏血吸虫S.mansoni尾蚴的向光性，设计出一个具有发光装置的过滤器，该装置可从仅含1条血吸虫尾蚴的2 L水中采集到尾蚴，回收率达98%。根据日本血吸虫的向上性和向光性，采用直接取样(主要采用300目的滤网对尾蚴进行过滤)和虹吸采样(利用尾蚴的向上性在水面收集尾蚴)对水体中尾蚴进行采集和实时定量PCR检测(Caitlinetal., 2011)。对8个村庄的疫水进行了检测，并同哨鼠法进行了比较，结果显示尾蚴捡获率分别为：直接取样1、2 d(1/47，4/47)，虹吸采样1、2 d(2/6，0/8)，哨鼠法(0/47)。Wang等(2016)设计了一台利用滤膜收集尾蚴的富集装置，并对采集时的流速和水中泥土对采集效果的影响进行了研究，结果显示0.07、0.25和0.33 L/s 3个流速的回收率分别为87.1%、90.1%和89.1%；水中加入1、1.5、2和2.5 g泥土时的回收率分别约为48%、51%、30%和26%，说明泥沙含量对回收率的影响更大。根据日本血吸虫尾蚴的水面静态生活习性及其生理特点，利用光热原理设计富集装置机械性收集尾蚴，在投蚴密度为1 600条/m2条件下，获蚴率为1.88%(高艳春等，2008)。

1.1.5其他尾蚴粘取法：采用尼龙绢、滤纸、网捞等为载体粘捞水体表面的尾蚴，亦可提高捕获率。陈光裕等(1965)在实验室内对尼龙绢粘取法与水面尾蚴密度进行了研究，当水面尾蚴密度大于34条/m2时，检测结果均为阳性；当密度小于19～20条/m2时，尾蚴检出率逐渐降低。利用尼龙布分别做成直径112 mm、长160 mm过滤袋，在实验室捞取水中日本血吸虫尾蚴(阳桂芬，2011)，结果发现150、100和50 pm尼龙过滤袋捞取尾蚴率均为100%。

1.2 尾蚴检测方法

环境水体中的尾蚴采集后需要进一步检测，检测方法主要有形态检查法和分子生物学检测方法(表2)。

表2 尾蚴检测方法对比

1.2.1形态检查法：形态检查法是目前尾蚴检测中的“金标准”(Panicetal.，2015)，是评估尾蚴活力的最常用方法，可以观察尾蚴的运动和形态，通常与C-6膜法或仿生动物膜采集方法联用。为了克服形态学检测法的主观性和耗时多等缺点，研究者采用不同的荧光染料对血吸虫尾蚴进行染色，再对尾蚴进行计数和形态学观察，即荧光染色法。利用Hoechst 33258(Hoechst)、二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)3种染料对尾蚴进行双重染色(FDA-PI染色法和FDA-Hoechst染色法)(Braunetal., 2020)，结果显示两种染色法都可以检测到尾蚴，不仅可以进行尾蚴计数，还可以确定其存活率，平均准确度为93.1% ± 5.5%(FDA-PI)和92.2% ± 6.3%(FDA-Hoechst)。荧光染色法比直接镜检法耗时少、更客观，更适用于定量测定水样中血吸虫尾蚴的存活率。

1.2.2分子生物学方法：由于目前流行区环境水体中尾蚴含量浓度低，而显微镜检方法易漏检，因此近年来实时定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)等分子生物学方法及检测技术陆续应用到水体中的尾蚴检测。

Driscoll等(2005)建立了一种高灵敏度和特异性的PCR检测法，用于检测实验室样品中的日本血吸虫尾蚴。钉螺和吸虫的群落结构可能比之前认为的更为复杂，因此，不能仅仅依靠PCR检测诊断，还需要利用测序来确认物种鉴定结果(Bakuzaetal.，2017)。Mesquita等(2020)建立的多重PCR能够鉴别出螺体内包括血吸虫在内的4个重要的吸虫科的尾蚴。徐明忠等(2021)应用RT-PCR对长沙综合枢纽工程库区洲滩水体表面日本血吸虫尾蚴进行了监测，基本确定该区域没有血吸虫尾蚴的存在。不仅如此，PCR还可以用于鉴别血吸虫尾蚴的性别，莫筱瑾等(2020)采集经动物实验确认的雄性和雌性尾蚴各40条，应用SCAR-PCR检测出其中37条雌性尾蚴和40条雄性尾蚴。检测单条雌性尾蚴的正确率为92.5%(37/40)，检测单条雄性尾蚴的正确率为100%(40/40)。可见PCR的鉴定方法不仅敏感性高、特异性强，且在一定程度上还可以鉴别血吸虫尾蚴性别，但受成本、操作水平、环境与条件限制，难以直接现场应用(Chevalieetal.，2016；Xuetal.，2019)。

LAMP法是一种等温核酸扩增技术(Tomitaetal.，2008)。此方法的最大优点是：基因的扩增和产物的检测可以一步完成，且扩增效率高。应用 LAMP 方法对日本血吸虫尾蚴阶段高表达基因簇进行初步检测，结果显示在16个备选基因中，有7个尾蚴及感染性钉螺基因组DNA检测结果均为阳性的基因，可考虑作为钉螺及疫水样本LAMP检测靶标基因(杨树国等，2017)。陈凤等(2021)比较了LAMP法和镜检法在血吸虫病传播阻断地区检测血吸虫感染性钉螺的效果，结果显示LAMP技术检测血吸虫感染性钉螺较传统解剖镜检法更敏感，可作为山丘型血吸虫病传播阻断流行区高危有螺现场检测方法的一种补充。此方法也可以成为野外感染钉螺中血吸虫尾蚴最直接的检测方法(Mesquitaetal.，2021)。

2 实时监测技术

2.1 基于生物传感器的尾蚴检测技术

生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号从而被检测的一种仪器，主要由生物感应元件和信号传导器两部分组成。将生物传感器应用到了血吸虫尾蚴的检测中，研究者根据血吸虫尾蚴阶段释放出的弹性蛋白酶制作出一种生物感应元件，设计、构建和测试了专门针对曼氏血吸虫的全细胞生物传感器(Webbetal.，2016)。该生物传感器适合检测曼氏血吸虫尾蚴，是第一个直接设计用于检测曼氏血吸虫的生物传感器。

2.2 现代化信息技术

为了实现疫水中尾蚴的快速测定，研究者们利用计算机信息技术等高科技手段来研究和识别血吸虫尾蚴。国内外学者利用计算机模型对血吸虫尾蚴的生物学特性进行了大量的研究，使用计算机模型通过拟合曲线找到了曼氏血吸虫尾蚴与温度之间的关系：15～35 ℃之间成S形，拟合曲线的回归线的斜率随着温度的升高呈指数增长(Lawsonetal.，1980)。利用计算机分析感官之间相互距离的各种参数(平均值、标准差、对称系数和峰值等)，成功鉴别了曼氏血吸虫尾蚴和间插血吸虫Schistosomeintercalatum尾蚴。它们具有相同的平均值和相同的标准偏差，但对称系数(0.34 ± 0.11、0.73 ± 0.08，P<0.0001)和峰值(-0.82 ± 0.27、-0.58 ± 0.31，P<0.0001)却大不相同，对称系数和峰值对于血吸虫虫种鉴别非常有效，可应用于其他几种血吸虫的鉴别(Chauetal.，1996)。我国研究者将计算机信息技术应用到疫水中尾蚴的检测，其主要原理是：利用显微镜成像技术和计算机的不同算法：Candy算子、特征加权法、同轴数字全息等。这类信息技术不仅能分辨出尾蚴的形态学特征，如尾蚴的轮廓和纹理，还能实现对疫水中尾蚴的实时监测(陈宇环等，2011；艾晶等，2012；王凤鹏等，2012；易云等，2012)。

3 小结

综上所述，环境水体中血吸虫尾蚴的监测主要包括两部分，即尾蚴采集与检测。疫水中尾蚴采集主要有哨鼠法、粘蚴法和仪器浓集法。哨鼠法具有安全、简易且可以鉴别虫种等优点，但在长期应用过程中逐步暴露出周期长、成本高、时效性差的不足。与哨鼠法相比，C-6膜和仿生动物膜采集尾蚴，不仅可以捡获日本血吸虫尾蚴，而且敏感性和效果更好。利用不同富集装置过滤能在一定程度上解决低浓度尾蚴带来的难捡获难题，但是尾蚴捡获过程中容易出现断尾，死亡甚至解体，因此对后期检测方法的要求更高。检测方法中，PCR和LAMP法可以弥补形态学镜检的缺陷，可以检测出死亡甚至解体的尾蚴。目前仍在进行的疫水实时监测技术，尚处于研究阶段，且人工智能识别效果受到尾蚴形态完整性的限制，灵敏度和准确度有待提高。