U0126对食管鳞癌细胞迁移的影响

刘丹辉 齐博 刘玉珍 陈智 赵宝生

(新乡医学院 1第一附属医院胸外科，河南 卫辉 453100；2食管癌研究所；3第一附属医院生命科学研究中心)

食管癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，主要分鳞癌与腺癌两大病理类型，在中国90%以上为食管鳞癌患者〔1〕。尽管目前对于食管癌的诊疗已经有了显著进步，如手术、化疗、放疗等，但由于高复发和转移的特性，其预后依然很差。细胞外信号调节激酶(ERK)作为丝裂原活化蛋白激酶家族成员之一，调控细胞内的多种信号分子发挥生物学效应〔2〕。ERK通过活化核因子κB等途径诱导抗凋亡基因的表达，促进凋亡蛋白的降解，促进肿瘤细胞的增殖、抑制其凋亡；丝裂原细胞外信号调节激酶(MEK)作为ERK的激酶，引起ERK磷酸化的发生。应用MEK抑制剂抑制ERK磷酸化(磷酸化ERK为ERK活化形式)，诱导细胞凋亡与周期阻滞，对不同类型的神经母细胞瘤、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞表现出抑制生长、促进凋亡的作用〔3～5〕。在肿瘤迁移及侵袭方面，ERK通过活化转录因子激活蛋白(AP)-1等促进细胞外基质的降解，利于肿瘤细胞的迁移，抑制ERK活性后肿瘤细胞的迁移及侵袭能力显著被抑制〔6〕。然而，临床试验发现MEK抑制剂治疗某些肿瘤并不能提高患者5年生存率，且有研究报道MEK抑制剂具有促进乳腺癌细胞迁移的作用〔7〕。目前有关MEK抑制剂对食管鳞癌细胞迁移的影响及其作用机制，国内外尚无相关报道。本研究旨在分析MEK抑制剂U0126对食管鳞癌细胞迁移的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 人食管癌细胞系KYSE-150购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，使用RPMI1640(含10%胎牛血清及1%青链霉素混合液)培养细胞。MEK抑制剂U0126购自美国APExBIO公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自碧云天公司，放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液购自博士德公司，Transwell小室购于美国 Corning 公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(1∶8 000)，磷酸化(p)-ERK1/2、E-钙黏蛋白(cadherin)、β-连环蛋白(catenin，1∶1 000)抗体购自美国CST公司，GADPH(1∶1 000)抗体购自武汉博士德公司。

1.2细胞培养及分组 用含10%胎牛血清及1%青链霉素混合液的RPMI1640培养基在37℃含5% CO2培养箱中培养 KYSE-150细胞，使细胞呈单层贴壁生长，每3 d传代一次。 U0126处理KYSE-150细胞，使其终浓度分别为0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L。

1.3Transwell细胞迁移实验检测细胞垂直迁移能力 取对数生长期细胞，用无血清的培养基RPMI1640重悬细胞(浓度为5.0×105/ml)，取200 μl(含细胞数1.0 × 105个)加入Transwell上室中，在下室加入600 μl含10% 胎牛血清培养基，将小室放入培养板中。分为0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L的 U0126组，于培养箱中培养24 h、48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，再用0.1%的结晶紫对下室底部细胞进行染色，并用棉签除去上室内侧的细胞。最后显微镜下观察细胞，取9个不同视野进行拍照计数，统计细胞数量。

1.4划痕实验检测细胞水平迁移能力 将细胞密度为5.0×105/ml 的细胞悬液加入6孔板中，在37℃含5%CO2培养箱培养过夜，经不同浓度U0126处理，在细胞上用200 μl 的枪头划横线三条继续培养。药物分别处理24 h、48 h后取出细胞，显微镜下观察细胞横向迁移情况，并在相同位置拍照。

1.5Western印迹实验 分别收集0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126处理的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，加入RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白。按每孔20 μg蛋白制备蛋白样品、上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。经5%脱脂牛奶室温下封闭1 h后，加入相应的一抗稀释液，4℃ 孵育过夜。回收一抗，TBST清洗3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗，室温孵育70 min，TBST清洗3次，电化学发光(ECL)法显影，采用凝胶成像设备观察结果并拍照，用ImagegJ 18.0图像分析软件测条带灰度值并比较各组间差异。

1.6统计学分析 采用Graphpad prism7软件进行t检验。

2 结 果

2.1U0126对食管鳞癌细胞垂直迁移的影响 0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126处理组的细胞穿膜细胞数〔(83.33±9.00)个、(240.00±2.49)个、(314.00±2.94)个〕较0.0 μmol/L U0126(对照)组〔(115.00±7.12)个〕明显增加，且处理组穿膜细胞数目随U0126浓度的增高而增加(P<0.01)。见图1。

图1 U0126对KYSE-150细胞垂直迁移的影响(结晶紫染色，×200)

2.2U0126对KYSE-150细胞水平迁移的影响 U0126促进KYSE-150细胞迁移，且随着U0126浓度及时间的增加，促进效应逐渐增强。0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126处理细胞24、48 h后横向迁移细胞数高于对照组除0.5 μmol/L 24 h时外，其余差异均具有统计学意义(P<0.01)。见表1和图2。

表1 U0126对KYSE-150细胞水平迁移的影响个，n=3)

图2 U0126对KYSE-150细胞水平迁移的影响(×200)

2.3U0126对KYSE-150细胞上皮间质转化相关蛋白表达的影响 0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126处理组 E-cadherin蛋白表达量明显低于对照组，而 β-catenin蛋白表达量明显高于对照组(P<0.01)，0.5、1.0 μmol/L U0126与p-ERK1/2表达较对照组无明显改变，但2.5 μmol/L U0126抑制p-ERK1/2表达(P<0.01)。见图3和表2。

1～4：对照组，0.5 μmol/L U0126组，1.0 μmol/L U0126组，2.5 μmol/L U0126组图3 U0126对KYSE-150细胞相关蛋白表达的影响

表2 U0126对KYSE-150细胞相关蛋白表达的 影响

3 讨 论

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率高，且预后差，是世界上最常见的第8大恶性肿瘤，中国90%以上为食管鳞癌患者〔8〕。由于食管癌具有高度侵袭性且易发生早期转移，其5年生存率不到20%。尽管许多抗肿瘤药物能抑制食管癌的进展，但有些患者治疗效果依然很差，其原因有待进一步阐明。Ras/MEK/ERK通路对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管生成等方面起着关键作用〔9～16〕。因此，ERK被认为是治疗癌症的合适靶点〔17〕。ERK活化促进癌细胞增殖，抑制凋亡，针对调控ERK的上游激酶的抑制剂，已被研发应用于临床试验。通过应用ERK激酶MEK抑制剂进而抑制ERK信号通路，抑制ERK磷酸化的发生，促进肿瘤细胞凋亡。例如，钙结合蛋白S100A12上调前列腺癌细胞ERK磷酸化水平，具有明显抗凋亡能力，MEK抑制剂MK-8353明显逆转该现象的发生〔18〕。此外，ERK磷酸化可通过调控转录因子的表达，利于EMT现象的发生，促进肿瘤细胞的迁移及侵袭能力。EMT即上皮到间质细胞的转化，通过修饰细胞表达的黏附分子，从而使其具有迁移和侵袭行为。上皮标志物E-cadherin和间充质标记物β-catenin、vimentin等均为EMT的标志蛋白，上皮标志物的下调与间充质标志物的上调预示着肿瘤细胞EMT现象的发生。Zheng等〔19〕研究证实钙蛋白酶家族成员Capn4通过ERK/c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化激活AP-1，促进鼻咽癌细胞迁移。ERK磷酸化水平上调，促使胰腺癌细胞EMT的发生，抑制ERK磷酸化水平上调E-cadherin的表达，下调vimentin的表达，降低胰腺癌细胞的迁移能力〔20〕。但是，也有研究发现MEK抑制剂PD98059通过EGFR信号的激活刺激β-catenin核积聚进而促进乳腺癌细胞迁移〔7〕。

已有文献报道10 μmol/L U0126对食管鳞癌细胞增殖无影响，但随着浓度的增加，其对食管鳞癌的增殖抑制作用明显增强〔21〕。前期通过对不同食管鳞癌细胞检测发现，U0126小于10 μmol/L对KYSE-450、EC9706细胞的迁移均无影响，但却明显促进KYSE-150细胞迁移。因此本研究进一步研究发现，MEK1/2抑制剂U0126以时间-剂量依赖性的方式抑制食管鳞癌KYSE-150细胞的迁移。

β-catenin通常作为关键的转录因子，促进肿瘤细胞的增殖和迁移〔22〕。β-catenin可通过上调基质金属蛋白酶(MMPs)在内的转移相关基因转录而促进肿瘤细胞运动能力的增强〔23〕。虽然β-catenin高表达发生在应用MEK抑制剂后，但是有研究表明，该现象的发生主要在于MEK抑制剂诱导EGFR信号通路的激活有关，与经典的RAF/MEK/ERK通路介导的细胞增殖、凋亡及迁移、侵袭无相关性〔7〕。由此提示，U0126影响食管鳞癌KYSE-150细胞的迁移可能不仅与调控ERK活性的基本作用有关，且还有可能通过非经典的ERK途径发挥作用。

综上，U0126可能是通过下调E-cadherin和上调β-catenin表达，诱导EMT的发生，促进KYSE-150细胞迁移。该研究为临床试验应用MEK抑制剂治疗某些肿瘤效果不理想做出合理解释，提示临床用药过程中不仅要考虑到用药个体化，还要考虑到用药的剂量，以此为临床抗癌药物的应用提供一定的理论指导。